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PCR - Coggle Diagram
PCR
PASOS
INICIO
Elevar la temperatura de la reacción a 94-96 °C (o 98 °C si se utiliza una polimerasa termoestable extrema).
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DESNATURALIZACION
Desnaturalización del ADN: Se separan las dos cadenas del ADN. Usualmente se logra calentando la muestra a 94-95 °C. Otros métodos son poco comunes, como la adición de sales o agentes químicos.
ALINEAMIENTO
Unión del cebador al ADN molde: Se baja la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos para permitir el alineamiento. La polimerasa comienza la síntesis de ADN, utilizando los cebadores como límites de la región a amplificar.
ELONGACION
Síntesis de la cadena complementaria: La ADN polimerasa utiliza el ADN molde y el cebador para sintetizar una nueva hebra de ADN complementaria. Se añaden dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente. La temperatura óptima para este paso varía según la ADN polimerasa utilizada; por ejemplo, para la polimerasa Taq, es de 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende de la ADN polimerasa y la longitud del fragmento de ADN a amplificar.
ELONGACION FINAL
Elongación final: Temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos para amplificar cualquier ADN de cadena simple restante.
CONSERVACION
Se realiza a temperatura ambiente por tiempo indefinido para preservar la reacción. La PCR se lleva a cabo en tubos de 0.2-0.5 ml en un termociclador. Para verificar los resultados, se emplea electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, o electroforesis capilar en PCR con marcaje fluorescente. El tamaño de los productos se determina utilizando un marcador de peso molecular de ADN.
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