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INGEGNERIA GENETICA, LE TECNICHE DI EDITING DEL GENOMA, la regolazione,…
INGEGNERIA GENETICA
ELETTROFORESI SU GEL
verifica che la reazione enzimatica sia avvenuta
si pone il DNA in un campo elettrico
migrerà dal polo negativo al polo positivo
tecnica che consente di separare molecole cariche mediante un campo elettrico
usando 2 polimeri
AGAROSIO
polisaccaride formato da molecole di galattosio legate tra loro
i polimeri di galattosio si intrecciano formando una rete e attraverso questi pori il DNA migra, formando "strisce", visualizzabili con il colorante
il gel di agarosio si fa solidificare in una vaschetta con un pettine dentellato, per formare i "pozzetti" per inserire il DNA
una volta solidificato il gel si trova in una
camera elettroforetica
genera campo elettrico
con un indicatore colorato si possono vedere i pezzi di gel che si spostano dal polo negativo al polo positivo con una velocità che dipende dalla loro dimensione
POLIACRILAMMIDE
polimero artificiale formato da catene di acrilamide
si effettua in modo simile ma il gel si solidifica tra 2 lastre di vetro
applicando un campo elettrico più intenso
una volta solidificata non può più essere portata allo stato liquido
permette la separazione di frammenti più piccoli
INSIEME DELLE TECNICHE PER MANIPOLARE L'INFORMAZIONE GENETICA DI UN'ORGANISMO
un
DNA ricombinante
è una molecola di DNA in cui è presente informazione genetica proveniente da organismi differenti
gli
enzimi di restrizione
sono capaci di idrolizzare il legame tra 2 nucleotidi in corrispondenza di sequenze chiamate
siti di restrizione
la maggior parte delle sequenze bersaglio sono
palindrome
(tessa successione, direzioni opposte)
5' GATATC 3' 3' CTATAG 5'
l'enzima più usato è
EcoRi
si lega alla sequenza palindroma e taglia GA nell'estremità 5' su entrambi i filamenti
generando estremità
coesive
altri enzimi effettuano il taglio in mezzo
EcoRV
taglia tra la A e la T
generando estremità
piatte
permettono di isolare un frammento di DNA
LE TECNICHE DI EDITING DEL GENOMA
TECNICHE CHE PERMETTONO DI INSERIRE UN GENE IN UN DETERMINATO PUNTO DEL GENOMA
esempio
CRISPER/Cas9
deriva dal meccanismo di difesa dei batteri dai virus
nel genoma dei batteri sono presenti frammenti di genomi di antichi virus che avevano attaccato la cellula
in caso di altre infezioni il Cas9 si appaia alla sequenza complementare sul DNA virale
si tratta di segmenti di DNA contenenti brevi sequenze ripetute, separati da spaziatori
inserendo in una cellula l'RNA guida e la sua sequenza complementare è possibile operare dei tagli precisi
PIANTE TRANSGENICHE
il
callo
(tessuto di una pianta)può essere coltivato per generare un
clone
se nelle cellule del callo si inseriscono geni esogeni, si ottengono
piante transgeniche
per trasferire in nuovi geni si utilizza il
plasmide Ti
e si integra con il cromosoma della pianta
il plasmide Ti viene sostituito con il
gene esogeno
viene inserito in una cellula priva del plasmide Ti naturale
viene inserito in un cromosoma vegetale
da queste cellule si ottengono
cloni vegetali
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la regolazione
durante la trascrizione
trascrizione differenziale
i geni
housekeeping
sono espressi in tutte le cellule
codificano enzimi e proteine
produce più copie di un gene per far aumentare la velocità di trascrizione
amplificazione genica
procarioti
il promotore è una sequenza di DNA
eucarioti
ci sono 2
sequenze di consenso
alle quali si legano proteine regolatrici che attivano il complesso di trascrizione
troviamo degli
intensificatori
legano i fattori di trascrizione stimolandone ulteriormente l'attività
infine i
silenziatori
arrestano la trascrizione in seguito al legame con appositi repressori proteici
prima della trascrizione
procarioti
i geni simili sono raggruppati in operoni e trascritti come unica entità
eucarioti
3 RNA polimerasi
RNA polimerasi II
trascrive i geni per le proteine
RNA polimerasi III
trascrive i geni per i tRNA
RNA polimerasi I
trascrive i geni per gli rRNA
nei cromosomi il DNA è avvolto attorno a proteine dette istoni
la trascrizione dipende dalla struttura della cromatina con il
rimodellamento della cromatina
2 tipi
eucromatina
contiene il DNA che viene trascritto in mRNA
eterocromatina
contiene i geni che non vengono trascritti
femmina XX maschio XY
il cromosoma X produce le proteine
quindi la femmina ha il doppio delle proteine?
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BIOTECNOLOGIE
gli
antibiotici
sono i primi farmaci delle biotecnologie tradizionali
il primo farmaco ottenuto grazie alle tecniche dell'ingegneria genetica fu l'
insulina ricombinante
ormone regolatore del metabolismo del glucosio e la sua assenza provoca il diabete
il gene dell'insulina umana è stato clonato e fatto esprimere prima nei batteri e poi nel lievito
anche le piante possono essere utilizzate per produrre farmaci
le piante di tabacco si usano per produrre anticorpi usati nella terapia di molte patologie
gli
anticorpi
sono proteine prodotte dai
linfociti B
ciascuna cellula produce uno specifico anticorpo che riconosce una precisa combinazione di amminoacidi che costituisce l'
antigene
per ottenere un anticorpo specifico si inietta in un topo l'antigene purificato
il topo produce diversi cloni di plasmacellule, ognuno per un diverso antigene
le plasmacellule prelevate dalla milza del topo sono messe in coltura con altre cellule per favorire la formazione di ibridomi
sollo gli ibridomi sopravvivono al terreno di coltura
il clone generato da ciascun ibridoma produce uno specifico
anticorpo monoclonale
con questi anticorpi si può studiare la localizzazione di una determinata proteina grazie alla
microscopia a immunofluorescenza
oppure seguire gli spostamenti della proteina nella cellula
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