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METODOLOGIA - Coggle Diagram

- - - - SEM
        (x superficie esterna)
        
        cellule e tessuti sia morti che vivi
        
        Immagini tridimensionali, per vedere le superfici delle cellule
        Anche in questo caso si utilizza un fascio di elettroni, però il campione deve essere trattato in modo che sia completamente METALLIZZATO
        (di solito di ORO), così questo fascio di elettroni che raggiunge il campione produce degli
        elettroni secondari che si generano per eccitazione che vengono raccolti da un sistema di
        rivelazione che crea un’immagine visibile in uno schermo.
      - TEM
        (x sezione di tessuto)
        
        osservabile l'“ultrastruttura cellulare”
        
        CATODO (in alto) è un filamento tungsteno che è attraversato da corrente e che va a generare elettroni attratti dall’ANODO (sotto).
        Il fascio di elettroni deve correre fino a raggiungere il campione attraversando diversi sistemi di lenti e deve fare questo in una
        condizione di VUOTO.
        Abbiamo una serie di lenti elettromagnetiche che orientano gli elettroni.
        Una volta che gli elettroni arrivano
        al RIVELATORE, questo crea un immagine digitale
        
        aree chiare (poco elettrondense) : dove gli elettroni sono
        passati con facilità.
        
        aree scure (elettrondense) : dove gli elettroni hanno trovato
        ostacolo
        
        varie variazioni di grigio : indicano una maggiore o minore elettrondensità
        
        cellule e tessuti morti
    - - MICROSCOPICO OTTICO CONVENZIONALE
        (x sezione di tessuto)
      - STEREOMICROSCOPIO
        (x superficie esterna)
      - tipologie di microscopi ottici
        
        MICROSCOPI IN CAMPO CHIARO
        la luce passa direttamente attraverso il campione
        
        MISCROSCOPI IN CAMPO OSCURI
        la luce è diretta sul campione con un determinato angolo
        
        MICROSCOPI A CONTRASTO DI FASE
        sistema di lenti che produce immagini visibili
        di campioni trasparenti. Utili per osservare cellule vive
        
        presenza di piano di fase o prismi che delineano i contorni con giochi di luce
        
        MICROSCOPI A FLUORESCENZA
        sfruttano e rilevano la fluorescenza dei campioni.
        Utili per lo studio della distribuzione di molecole di interesse
        
        Fluorescenza = capacità di alcune molecole di assorbire la luce ad una determinata lunghezza
        d’onda e di emetterla ad una lunghezza d’onda maggiore.
        
        NATURALE : prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto
        
        SECONDARIA : indotta da una colorazione con sostanze fluorescenti (fluorocromi)
        
        MICROSCOPI A LUCE POLARIZZATA
        filtro polarizzatore che evidenzia sostanze cristalline o
        altamente ordinate che danno birifrangenza
        (es. collagene, microtubuli, microfilamenti)
        
        MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO
        2 lenti che ingrandiscono:
        
        immagine ingrandita dagli obiettivi e proiettata sugli oculari
        
        gli oculari ingrandiscono ancora proiettando l’immagine direttamente all' occhio
        
        parte meccanica
        
        marte ottica
        
        L’ingrandimento TOT = moltiplicazione dell’ingrandimento
        dell’obiettivo e l’ingrandimento di cui è capace il mio oculare
    - - permette di osservare campioni con una
        risoluzione molecolare e atomica
      - Non è necessario il trattamento preventivo del campione,
        quindi posso lavorare con materiale vivo
  - - - limite di risoluzione:
      - Microscopio ottico = risoluzione 0.2 micron
        TEM = 0.2 nanometri
        SEM = 10 nanometri
- - - - scopo
        
        Studiare la morfologia
        
        Preparare organi e tessuti per l’analisi istologica
        
        Rinvenire parassiti negli organi
        
        Definire la condizione riproduttiva
        
        Espiantare materiale vivente per trapianti
      - procedura
        
        Preparare gli strumenti necessari
        
        Orientare correttamente l’animale
        (di solito gli invertebrati vengono dissezionati
        dalla superficie dorsale, i vertebrati da quella ventrale)
        
        Aprire con cautela le cavità corporee per non danneggiare gli organi
        
        Finalità della dissezione
      - vantaggi dello stereomicroscopio
        
        Immagine dritta (non invertita) e tridimensionale
        
        Possibilità di osservare campioni a fresco, non necessariamente su vetrino
        
        Notevole distanza tra obiettivo e piano di osservazione
        
        Illuminazione del preparato dall’alto e/o dal basso
    - - scopo
        
        impedire alterazioni post mortem dei tessuti
        
        conservare il materiale nelle condizioni più simili possibili a quelle vitali
        
        immobilizzare i costituenti cellulari e tissutali del campione
        
        proteggere i tessuti dagli stress delle fasi successive
      - metodi
        
        fisici : utilizzo di alte o basse temperature
        
        chimici : basati sull’uso di sostanze o miscele, chiamate fissativi
      - fattori importanti
        
        Tempestività della fissazione (non appena si disseziona)
        
        Scelta del fissativo
        
        Quantità di fissativo: rapporto 10:1 v/v tra fissativo e campione
        
        Tempo di fissazione per evitare sotto- o sovra-fissazione
      - principali fissativi
        
        Aldeidi: Formaldeide/FORMALINA (4-10 %) uno dei più utilizzati in istologia (12-24h); GLUTERALDEIDE (2-3 %): fissativo indicato per piccoli pezzi destinati al TEM
        
        Alcoli: ETANOLO (70-100 %)
        
        Acidi organici e minerali: ACIDO ACETICO, a. tricloroacetico, a. picrico, a. cromico
        
        Sali di metalli pesanti: bicromato di potassio, cloruro di mercurio
      - miscele di fissazione
        
        LIQUIDO DI BOUIN: miscela di acido picrico, acido acetico e formalina (colore
        giallo intenso). Ottimo fissativo, indicato per pezzi voluminosi (8-10 h)
        
        LIQUIDO DI CARNOY: miscela di etanolo, cloroformio ed acido acetico. Usato
        soprattutto per fissare cellule isolate
    - - INCLUSIONE = infiltrazione del campione con un mezzo di inclusione allo scopo di
        conferire al frammento la durezza e la compattezza necessarie per procedere alla sezione in sottili fettine.
        Di solito si usa la PARAFFINA.
      - fasi
        
        disidratazione in solventi organici (etanolo) a gradazione crescente
        
        chiarificazione : immersione nel solvente (xilolo) del mezzo di inclusione
        
        infiltrazione: passaggi nel mezzo di inclusione allo stato liquido (paraffina fusa)
        
        solidificazione del mezzo di inclusione contenente il campione all’interno di un’apposita formella che verrà poi rimossa.
      - strumenti
        
        centralina di inclusione
        
        processatore automatico
    - - piano: saggittale ; sezione: saggittale
      - piano: trasversale ; sezione: trasversale
      - piano: frontale ; sezione: longitudinale
      - microtomia
        
        CRIOSTATO
        Particolare microtomo, contenuto all’interno di una cella frigorifera, usato per
        tagliare campioni congelati.
        Il congelamento è un processo alternativo alla fissazione chimica e successiva inclusione ed è utile per campioni che necessitino di diagnosi rapida o di cui non si voglia alterare la composizione.
        Le sezioni criostatiche hanno uno spessore 10-30 μm, vengono fatte aderire ai vetrini che si conservano a -80°C fino a quando verranno sottoposte a colorazione
        
        ULTRAMICROTOMO
        serve per tagliare campioni inclusi in resine epossidiche, destinati all’osservazione al TEM.
        E’ provvisto di un binoculare ed utilizza una lama di vetro o di diamante. Permette di ottenere
        sezioni molto sottili.