Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
BIO-GENETICA MOLECOLARE CAP. 4, Regolazione dell'espressione genica…
-
Regolazione dell'espressione genica NEGLI EUCARIOTI
https://www.youtube.com/watch?v=8x39mztTDnY
- è più articolata di quella dei procarioti
- in primo luogo i geni degli eucarioti non sono raggruppati in operoni
- in secondo luogo la regolazione risponde a esigenze differenti --> se nei procarioti serve per produrre le proteine di volta in volta necessarie per utilizzare i nutrienti disponibili nell'ambiente, negli eucarioti pluricellulari è indispensabile per permettere il differenziamento.
- differenziamento --> tutte le cellule di un organismo pluricellulare hanno lo stesso DNA, ma esistono vari tipi di cellule (una cellula del cervello è diversa da una cellula del fegato) --> diversi tipi di cellule esprimono quindi set di geni diversi perché per ES un gene che codifica per una proteina necessaria alle funzionalità del cervello sarà inattivo nelle cellule del fegato e viceversa
- la regolazione negli eucarioti avviene a vari livelli -->
- nella struttura della cromatina (controllo conformazionale)
- nella trascrizione
- dopo la trascrizione, nel processamento del pre-mRNA
- nella traduzione
- dopo la traduzione, nella modificazione delle proteine già tradotte (controllo nelle modificazioni post-traduzionali)
1. controllo conformazionale -->
- ci sono due tipi di cromatina: eucromatina (poco condensata ed è quella che viene trascritta) e eterocromatina (più condensata e non trascritta perché inaccessibile all'RNA polimerasi).
- un punto di controllo della regolazione genica è quindi già qui --> nell'accesso differenziale ai due tipi di cromatina da parte della trascrizione.
- i geni all'interno dell'eterocromatina non vengono quindi espressi
2. controllo nella trascrizione -->
- coinvolge sempre proteine regolatrici che si legano a siti specifici sulla molecola del DNA ma è molto + complesso di quello dei procarioti
- come nei procarioti l'RNA polimerasi si lega al promotore
- le proteine regolatrici, dette fattori di trascrizione, si legano al DNA in corrispondenza di due siti, due particolari sequenze, poste a volte anche a grande distanza dal gene trascritto:
a) intensificatori (enhancer) --> che aumentano la velocità di sintesi dell'RNA.
b) silenziatori (silencer) --> inibiscono la trascrizione
- i fattori di trascrizione si legheranno a uno di questi due siti fungendo così da attivatori o da inibitori.
- il controllo della trascrizione è legato anche a modificazioni chimiche a carico del DNA, in particolare questo processo coinvolge la metilazione (il DNA viene metilato quando determinati enzimi aggiungono gruppi metilici a determinate citosine) di alcuni nucleotidi di citosina nelle sequenze geniche che non vengono trascritte. La metilazione di un tratto di DNA rende più forte l'inattivazione dei geni presenti al suo interno.
3. dopo la trascrizione -->
- la regolazione dell'espressione genica si attua attraverso i trascritti primari di mRNA che modificati e maturati migrano nel citoplasma (cappuccio + poliadenilazione + splicing), mentre quelli non maturi restano nel nucleo e sono poi degradati.
- il trascritto primario di mRNA può essere elaborato in maniere differenti, assemblando diversamente gli esoni e producendo così più di una proteina a partire dallo stesso mRNA.
4. controllo della traduzione -->
- si attua attraverso il legame dell'mRNA a proteine inibitrici presenti nel citoplasma, che si legano alla sua estremità 5', impedendo il legame con il ribosoma.
5. controllo delle modificazioni post-traduzionali -->
- alcune proteine vengono sintetizzate come precursori inattivi e si convertono in forma attiva attraverso la rimozione di porzioni specifiche della catena polipeptidica --> maturazione proteolitica, oppure diverse modificazioni della catena.
SINTESI PROTEICA (TRADUZIONE)
- ha sede sui ribosomi
- partecipano tutti e tre i tipi di RNA --> l'mRNA che trasporta il messaggio, l'rRNA che è parte integrante del ribosoma, e il tRNA che fa da interprete traducendo il linguaggio degli acidi nucleici in quello delle proteine.
- il tRNA è in grado da un lato di legare gli amminoacidi, dall'altro di riconoscere i codoni dell'mRNA grazie al fatto che su una delle sue estermità possiede una tripletta di nucleotidi, detta anticodone, complementare a uno specifico codone sull'mRNA.
- dalla parte opposta rispetto al legame codone-anticodone si lega al tRNA l'amminoacido corrispondente.
- i ribosomi possiedono tre siti di legame --> uno per l'mRNA nella subunità minore, e due per il tRNA: il sito P (sito peptidilico) e il sito A (sito amminoacilico).
IMG_6598
- la sintesi di una proteina avviene in tre fasi:
IMG_6945
tRNA -->
- molecole piccole formate da circa 80 nucleotidi e rappresentabili con una struttura a trifoglio.
- ogni cellula ne contiene almeno un tipo per ogni amminoacido
- il legame fra un tRNA e lo specifico amminoacido è catalizzato da uno specifico enzima amminoacil-tRNA-sintetasi.
1. INIZIO
- l'mRNA si lega alla subunità minore del ribosoma
- a questo complesso si associa sopra ai due la subunità maggiore del ribosoma e il primo tRNA legato al suo specifico amminoacido, che si appaia con il suo anticodone al codone di inizio e va a occupare il sito P (peptidilico).
2. ALLUNGAMENTO
- un secondo complesso tRNA-amminoacido entra nel sito A
- si forma il legame peptidico tra i primi due amminoacidi quando il primo amminoacido si stacca dal proprio tRNA.
- si prosegue con la liberazione del primo tRNA posizionato nel sito P e ciò avviene con lo scorrimento del ribosoma lungo la molecola di mRNA in modo che tale tRNA finisca nel sito E (exit), dal quale può lasciare il ribosoma.
- ne consegue che il complesso tRNA polipeptide in formazione si sposta nel sito P.
- il sito A è ora libero e può accogliere un nuovo complesso tRNA-amminoacido
- il processo si ripete centinaia di volte permettendo alla catena polipeptidica di allungarsi.
3. TERMINAZIONE
- il ribosoma arriva ad uno dei tre codoni di stop, a cui non corrisponde nessun tRNA
- una particolare proteina (release factor) legge il codone di stop e la traduzione si interrompe
- la proteina neosintetizzata si stacca dal tRNA, cha a sua volta abbandona il ribosoma
- le due subunità del ribosoma si dissociano
- si riproducono in modo asessuato, per scissione binaria --> DNA replicato e distribuito identico alla due cellule figlie.
- così il materiale genetico rimane sempre uguale --> ma esistono alcuni meccanismi che permettono di scambiare geni tra le cellule batteriche diverse, aumentando la variabilità genetica della popolazione:
1. TRASFORMAZIONE --> processo mediante il quale un frammento di DNA, presente nell'ambiente in seguito alla morte di una cellula batterica, penetra in un altro batterio e si integra nel genoma di questo, sostituendo il tratto omologo nel suo DNA e creando così una nuova combinazione di geni.
- le specie di batteri in grado di fare ciò sono dette competenti e lo fanno grazie alla presenza di recettori per il DNA sulla superficie cellulare.
- i batteri non competenti possono diventarlo grazie a metodologie di laboratorio.
2. TRASDUZIONE --> alcuni batteriofagi possono agire come vettori di geni, trasportando geni batterici da una cellula a un'altra.
- si riconoscono due tipi di trasduzione:
a) trasduzione generalizzata: viene incorporato nel capside un frammento qualsiasi del DNA dell'ospite.
b) trasduzione specializzata: viene trasferito un frammento di DNA batterico adiacente al punto di inserimento del profago.
3. CONIUGAZIONE --> in molti batteri, oltre alla molecola di DNA principale sono presenti piccole molecole circolari di DNA, chiamate plasmidi, contenenti pochi geni che determinano caratteristiche utili alla cellula, ma non indispensabili per la sopravvivenza.
- i plasmidi si replicano in modo autonomo rispetto al DNA principale
- la maggior parte di essi possiede la capacità di passare facilmente da una cellula batterica a un'altra.
- si conoscono diversi tipi di plasmidi --> plasmidi R, che portano i geni per la resistenza ai farmaci, e il plasmide F, o plasmide della fertilità dell'Escherichia Coli.
- il plasmide F può promuovere la coniugazione, un processo in cui il DNA del plasmide è trasferito da un batterio donatore a un batterio ricevente attraverso un ponte citoplasmatico formato da appendici, dette pili coniugativi, che si formano sul batterio donatore.
- le cellula dell'E.Coli prive del plasmide F sono dette cellule F-, mentre quelle che lo contengono F+.
- CONIUGAZIONE --> una cellula F+ replica il proprio plasmide e ne trasferisce una copia alla cellula F- attraverso un pilo coniugativo. La cellula F- si trasforma così in una cellula F+, diventando capace di produrre pili e di coniugare.
- la coniugazione è quindi simile alla trasduzione, in quanto comporta il trasferimento di geni batterici da una cellula a un'altra, in questo processo però i geni sono trasportati da plasmidi e non da virus.
IMG_7116
MUTAZIONI PUNTIFORMI
Perdita o aggiunta -->
- la perdita o l'aggiunta di un nucleotide hanno come effetto lo spostamento della griglia di lettura (sono dette frame-shift), con conseguente alterazione di tutto il filamento
- questo porta alla produzione di una proteina completamente priva di attività biologica
- per questo sono quasi sempre responsabili di effetti molto gravi
Sostituzione -->
- la sostituzione di un nucleotide può invece portare alla produzione di un codone sinonimo, dando luogo a una mutazione silente, oppure può provocare due tipi di mutazioni:
- mutazione missenso --> dà origine a un codone che codifica un amminoacido diverso da quello originario
2. mutazione non senso --> dà origine ad uno dei tre codoni di stop che segnalano l'arresto della sintesi della proteina. Come le mutazioni frame-shift, quindi di perdita o aggiunta di un nucleotide, hanno sempre effetti gravissimi.
Il modello dell'operone
- è il sistema più noto di regolazione genica nei procarioti
- un operone è un tratto del cromosoma batterico (Escherichia Coli) costituito da un promotore (sito di attacco dell'RNA polimerasi), un operatore (è dopo il promotore ed è una breve sequenza di basi a cui si lega la proteina repressore), e uno o più geni strutturali (geni che codificano per specifiche proteine).
- sono noti due tipi di operoni:
- operoni inducibili
- operoni reprimibili
1. operoni inducibili -->
- non sono normalmente espressi perchè la loro trascrizione richiede la presenza di una sostanza, detta induttore, che inattiva il repressore.
- il repressore è legato all'operatore impedendo all'RNA polimerasi di legarsi al promotore per trascrivere i geni strutturali
- il repressore è attivo fino a che non si lega all'induttore formando un complesso repressore-induttore che si stacca dall'operatore, permettendo all'RNA polimerasi di legarsi al promotore e di iniziare la trascrizione.
- l'induttore è di solito il substrato su cui gli enzimi, per cui i geni strutturali codificano, agiscono --> grazie a questo sistema gli enzimi vengono sintetizzati solo quando è presente il loro substrato e quindi soltanto quando sono effettivamente necessari.
- un esempio di operone inducibile è fornito dall'operone lac --> l'operone che contiene i tre geni strutturali necessari per l'utilizzo del lattosio in E. coli.
- in assenza di lattosio l'operone è inattivo e i tre geni non vengono espressi. In presenza di lattosio, questo zucchero funge da induttore, legandosi al repressore e inattivandolo. L'RNA polimerasi può così legarsi al promotore e trascrivere i tre geni in mRNA.
2. operoni reprimibili -->
- sono normalmente espressi perchè in un operone reprimibile il repressore è normalmente inattivo e l'operone viene perciò trascritto regolarmente. Tranne quando è presente un corepressore che si lega al repressore attivandolo e formando il complesso repressore-corepressore che si lega a sua volta all'operatore, impedendo all'RNA polimerasi di trascrivere i geni strutturali dell'operone.
- un corepressore è spesso il prodotto finale della via biosintetica che esso controlla --> ES: operone trp che codifica gli enzimi incaricati alla sintesi dell'amminoacido triptofano in E. coli. In assenza di triptofano, l'operone è attivo e i geni degli enzimi necessari per la sintesi dell'amminoacido vengono trascritti. Quando il triptofano è presente gli enzimi che lo sintetizzano non sono più necessari e quindi la loro produzione cessa. Il triptofano agisce quindi infatti come corepressore.
Replicare il proprio genoma --> la strategia adottata per replicare il genoma dipende dal tipo di acido nucleico virale:
- nei virus a DNA --> il DNA virale si replica normalmente e viene trascritto sotto forma di mRNA, che dirigerà poi la sintesi delle proteine virali utilizzando la DNA polimerasi, l'RNA polimerasi, i nucleotidi e gli amminoacidi della cellula ospite.
- nei virus a RNA --> 1. in alcuni l'acido nucleico è replicato da un enzima detto RNA replicasi che sintetizza nuovo RNA utilizzando come stampo l'RNA virale. 2. in altri, chiamati retrovirus, l'RNA virale viene utilizzato come stampo per copiare un singolo filamento di DNA complementare (cDNA), mediante un enzima detto trascrittasi inversa, penetrato nella cellula infettata insieme all'acido nucleico del virus. Poi il filamento di cDNA fa a sua volta da stampo per la sintesi di un filamento complementare di DNA, formando una doppia elica di cDNA. Questa si integra poi nel genoma della cellula ospite e viene trascritta per dare mRNA e nuove molecole di RNA virale.
- i costituenti virali così sintetizzati vanno incontro a un processo di autoassemblaggio che consente la produzione di centinaia di nuovi virus.
- i virus completi fuoriescono dalla cellula ospite attraverso la lisi della cellula infettata, che viene quindi distrutta, oppure possono essere espulsi mediante un processo simile all'esocitosi che permette la moltiplicazione virale senza uccidere la cellula ospite.
ES: il SARS-CoV-2 è un virus a RNA a singolo filamento ed è l'agente eziologico della COVID-19. Possiede 4 proteine, di cui una lega il genoma, mentre le altre tre costituiscono il capside. Di queste la principale è denominata spike, o proteina S: essa ha affinità con una proteina situata su alcune nostre cellule, chiamata ACE2, che funge quindi da recettore per il virus.
VIROIDI E PRIONI
- viroidi --> agenti patogeni costituita da piccole molecole circolari di RNA a singolo filamento.
- noti soltanto nelle piante dove causano numerose malattie
- prioni --> particelle di natura solo proteica (no acidi nucleici) responsabili di malattie che colpiscono il sistema nervoso.
- ES negli animali: la scrapie degli ovini, l'encefalopatia spongiforme bovina
- ES negli uomini: la malattia di Jakob-Creutzfeldt caratterizzata da demenza, scosse muscolari di tipo epilettico e degenerazione del sistema nervoso, fino alla morte. Morbo della mucca pazza --> variante della malattia di Jakob-Creutzfeldt che può essere trasmessa all'uomo da mucche affetta da encefalopatia spongiforme bovina.
- indaga i meccanismi chimici che permettono la trasmissione dei caratteri ereditari da un individuo ai propri discendenti.
- l'unità base dell'eredità è rappresentata dal gene, nonché il tratto di DNA responsabile della determinazione di un dato carattere.
- già dagli anni 40 si sapeva che i geni determinano i caratteri ereditari e che sono localizzati sui cromosomi, ma non se ne conosceva l'esatta natura chimica.
- dato che i cromosomi sono fatti di acido desossiribonucleico (DNA) e proteine si credeva che il depositario dell'informazione biologica fosse una di queste due molecole --> si credeva le proteine perchè il DNA era formato da solo 4 nucleotidi e quindi troppo semplice per l'informazione genetica.
- nel 1944 Avery, MacLeod e McCarty dimostrarono che il depositario era proprio il DNA.
Nucleotidi
- un nucleotide è formato da una base eterociclica azotata, uno zucchero pentoso (ribosio nell'RNA o 2-desossiribosio nel DNA) e un gruppo fosfato che è un derivato dell'acido fosforico.
- il pentoso rappresenta l'elemento centrale dei nucleotidi, in quanto a lui si legano il gruppo fosfato e la base azotata.
- il legame chimico che tiene uniti il pentoso e il gruppo fosfato è un legame fosfodiesterico, mentre il legame chimico che unisce il pentoso e la base azotata è un legame N-glicosidico.
- idrolizzando un nucleotide si ottiene una molecola di acido fosforico e un nucleoside (molecola organica, derivante dall'unione tra un pentoso e una base azotata).
- le basi azotate si dividono in due gruppi:
- basi pirimidiniche/pirimidine --> citosina, timina e uracile
2. basi puriniche/purine --> adenina e guanina
Struttura del DNA
- il DNA è un acido nucleico ed è quindi un polimero lineare di nucleotidi
- James Watson e Francis Crick delinearono il noto modello della doppia elica.
- secondo il loro modello la molecola è costituita da due filamenti polinucleotidici avvolti a elica intorno a un asse centrale.
- appunto ogni filamento è formato da diversi nucleotidi, è uno scheletro di molecole di zucchero e gruppi fosfato alternati: il gruppo ossidrilico del C5' di un'unità di ribosio è legato al gruppo ossidrilico del C3' del ribosio successivo attraverso un legame (o ponte) fosfodiestereo. A ogni molecola di zucchero è legata una base azotata, quindi le basi sporgono lateralmente dai filamenti.
- i due filamenti sono uniti da legami a idrogeno tra le basi azotate
- le basi azotate non si appaiano tra i due filamenti in modo casuale --> l'appaiamento ha luogo necessariamente tra una purina (formata da due anelli) e una pirimidina (formata da un solo anello), in particolare l'adenina si appaia con la timina tramite due legami a idrogeno, mentre la guanina con la citosina tramite tre legami a idrogeno. Le basi appaiate sono dette complementari.
- In modo più semplice --> la struttura del DNA è paragonabile a quella di una scala a chiocciola, in cui le ringhiere sono formate da unità alternate di zucchero e gruppo fosfato, mentre i pioli sono costituiti dalle coppie di basi complementari appaiate.
- la distanza tra una coppia di basi e la successiva è di 3,4 Å.
- ogni giro completo dell'elica comprende 10 coppie di basi.
- ogni filamento ha un'estremità 5' e un'estremità 3' --> per convenzione si ha stabilito che l'estremità 5' rappresenta il capo di un filamento, mentre l'estremità 3' ne rappresenta la coda.
Dal punto di vista chimico, l'estremità 5' coincide con il gruppo fosfato del primo nucleotide della catena, mentre l'estremità 3' coincide con il gruppo ossidrilico (OH) posto sul carbonio 3 dell'ultimo nucleotide.
- nella doppia elica l'estremità 3' di un filamento fronteggia l'estremità 5' di quello complementare --> quindi i due filamenti si dicono antiparalleli.
-
IL DNA
Replicazione del DNA
- per essere trasmesso ai discendenti il DNA deve duplicarsi --> Replicazione che ha luogo prima che una cellula si divida.
- i due filamenti della doppia elica si separano come in una cerniera lampo grazie alla rottura dei legami a idrogeno tra le basi appaiate.
- ciascun filamento funzionerà poi come stampo per la sintesi di un nuovo filamento a esso complementare.
- Meselson e Stahl dimostrarono che la replicazione del DNA è semiconservativa --> ognuna delle due molecole figlie di DNA è costituita da un filamento del DNA parentale (conservato) e da un filamento sintetizzato ex novo.
IL PROCESSO
- richiede energia e molti enzimi e proteine, in particolare per srotolare la doppia elica nel punto di origine di replicazione, detto forcella di replicazione.
- però la sintesi vera e proprio del nuovo filamento è catalizzata invece da un gruppo di enzimi noti come DNA polimerasi.
- il DNA polimerasi non può sintetizzare direttamente un nuovo filamento di DNA sul filamento parentale, ma ha bisogno di un primer, o innesco, cioè un breve tratto a doppia elica da cui iniziare la sintesi. --> ciò è permesso dalla sintesi di un breve filamento di RNA
- la replicazione procede sempre in direzione 5' --> 3' e questo ha una conseguenza importante: uno dei due filamenti, detto filamento guida (leading strand) può essere sintetizzato in maniera continua utilizzando un unico innesco, mentre l'altro filamento, chiamata filamento lento (lagging strand) deve essere sintetizzato in direzione opposta, sotto forma di piccoli frammenti discontinui, chiamati frammenti di Okazaki, uniti in seguito.
- il processo è però molto rapido --> 50 nucleotidi al secondo nei mammiferi e 500 nei procarioti.
- la DNA polimerasi, oltre ad aggiungere nuovi nucleotidi alla catena in crescita (funzione polimerasica), individua anche eventuali nucleotidi sbagliati aggiunti al filamento in costruzione. In caso di errore l'enzima inverte la sua direzione di marcia rimuovendo i nucleotidi uno a uno fino ad arrivare al nucleotide sbagliato (funzione esonucleasica).
- anche altri enzimi come i nucleasi di restauro del DNA hanno il compito di eliminare errori dopo la replicazione, sostituendoli con queliìli corretti.
https://www.youtube.com/watch?v=ttzyzTSPLI4
Avviene con modalità leggermente differenti nei procarioti e negli eucarioti --> nei procarioti vi è un unico punto di origine della replicazione e il processo avviene nel citoplasma. Mentre negli eucarioti vi sono diversi punti di origine in ogni cromosoma e la replicazione ha luogo nel nucleo.
L'ipotesi un gene-un enzima
- per capire come il DNA svolgesse la funzione di contenere tutte le info per definire lo sviluppo e la fisiologia di una cellula si effettuarono degli studi su microrganismi biochimicamente alterati in seguito a mutazioni.
- studiando i mutanti (organismi che presentano una mutazione) della muffa del pane G. Beadle e E. Tatum dimostrarono l'esistenza, per ciascuna mutazione, di un corrispondente enzima funzionante in modo anomalo.
- formularono quindi l'ipotesi "un gene-un enzima" --> un determinato gene è responsabile della sintesi di un determinato enzima, cioè codifica per quell'enzima.
- l'espressione fu poi modificata in "un gene-una proteina" perché non tutte le proteine, la cui sintesi è controllata dal DNA, sono enzimi.
- ("un gene-una catena polipeptidica" perchè le proteine sono spesso costituite da due o + subunità)
-
TRASCRIZIONE
- la sintesi dell'mRNA è catalizzata da un gruppo di enzimi, il più importante dei quali è l'RNA polimerasi.
- i due filamenti del tratto di DNA corrispondente al gene si aprono e uno di essi funziona da stampo per la sintesi di una molecola di mRNA a esso complementare, con un meccanismo simile a quello della replicazione.
- l'RNA polimerasi si sposta lungo il filamento stampo di DNA e si lega a una sequenza specifica sul DNA, detta promotore, aggiungendo via via nuovi ribonucleotidi al filamento di mRNA nascente. La trascrizione avviene in direzione 5' --> 3'.
- un'altra sequenza specifica è quella che indica il punto di arresto della trascrizione ed è detta segnale di terminazione.
IMG_6912
NB: nella trascrizione, a differenza della replicazione, viene copiato solo uno dei due filamenti di DNA, riconosciuto dalla RNA polimerasi per la presenza del promotore.
- nei procarioti la trascrizione avviene nel citoplasma quindi l'mRNA prodotto può essere utilizzato subito per la sintesi proteica.
- negli eucarioti invece la trascrizione ha luogo nel nucleo e l'mRNA deve essere modificato prima di migrare nel citoplasma.
- modifica dell'mRNA --> i geni degli eucarioti pluricellulari sono discontinui --> formati da un'alternanza di sequenze codificanti (che codificano per le proteine, le sintetizzano, vengono tradotte in esse), dette esoni e sequenze non codificanti dette introni. Il filamento di DNA di un gene discontinuo viene trascritto interamente copiando sia gli esoni che gli introni e formando quindi un mRNA immaturo. Prima che l'mRNA lasci il nucleo gli introni vengono quindi eliminati e gli esoni saldati per formare l'mRNA maturo. Processo detto splicing.
IMG_6913
Prima dello splicing l'mRNA degli eucarioti subisce due processi:
- mentre l'mRNA è ancora in trascrizione, all'estremità 5' viene aggiunto un cappuccio di un nucleotide: la 7-metilguanosina che protegge l'mRNA dalla degradazione.
- all'estremità 3' viene aggiunta una coda di 100-250 nucleotidi di adenina in un processo detto poliadenilazione, che favorisce l'esportazione dal nucleo al citoplasma ed è necessaria per una corretta traduzione.
- Nei mammiferi il tasso medio di mutazione è di circa 1 gene per 500.000 gameti.
- le mutazioni sono eventi spontanei, ma la loro frequenza può essere aumentata da fattori chimici o fisici, detti agenti mutageni.
- sono mutageni fisici i raggi ultravioletti, i raggi X e le radiazioni emesse dai materiali radioattivi.
- un esempio di mutagene chimico è l'acido nitroso (HNO2) che provoca la trasformazione della citosina in uracile. Altri chimici sono pesticidi, diserbanti,...
-
Regolazione dell'espressione genica NEI PROCARIOTI
- avviene a livello della trascrizione --> vengono trascritti in mRNA solo i tratti di DNA corrispondenti alle sequenze geniche che devono essere tradotte in proteine.
- la trascrizione è controllata da specifiche proteine di regolazione, codificate da geni regolatori.
- la proteina di regolazione può agire come repressore (quando si lega al DNA bloccando la trascrizione del gene) oppure come attivatore (quando facilita l'attacco dell'RNA polimerasi al promotore e quindi la trascrizione del gene).
questo sistema di controllo è così efficace e semplice anche perchè nei procarioti manca il nucleo e quindi trascrizione e traduzione sono strettamente accoppiate, e ciò porta al fatto che l'mRNA inizia a essere tradotto dai ribosomi prima ancora che la sua sintesi sia terminata.
ASPETTI PARTICOLARI DEL GENOMA DEGLI EUCARIOTI
- solo il 2% del DNA codifica per le proteine, il restante 98% viene definito non-coding DNA (ncDNA)
- funzioni del ncDNA -->
- una parte è inglobata nei geni sottoforma di introni
- alcune sequenze vengono trascritte, ma il prodotto ottenuto non è mRNA, ma tRNA, rRNA o piccoli RNA con funzione regolatrice dell'espressione genica (ES: i microRNA)
- un'altra parte è dispersa nel genoma sotto forma di sequenze ripetute, le quali possono costruire parti strutturali dei cromosomi come i centromeri e i telomeri, avere funzione regolatrice della trascrizione oppure sono elementi mobili chiamati trasposoni.
- i trasposoni sono in grado di spostarsi da un punto all'altro del cromosoma, modificando le sequenze originarie --> a causa della presenza di un gene che codifica per un enzima responsabile del movimento, la trasposasi.
- l'inserimento di un trasposone in una sequenza di DNA codificante o in una regione di controllo può danneggiare la sequenza.
- i trasposoni si possono trovare anche nei procarioti.
TELOMERI
- sequenze di nucleotidi ripetuti poste all'estremità dei cromosomi
- hanno un ruolo protettivo in quanto ogni volta che il DNA si replica vanno persi brevi tratti di DNA posti alle estremità del filamento.
- a ogni replicazione quindi il telomero si accorcia
- non si accorcia quando nella cellula è presente l'enzima telomerasi che ripristina la lunghezza originale.
- i telomeri controllano la morte cellulare --> dopo 50-70 divisioni i telomeri sono ormai troppo corti e la cellula muore.
ENZIMI DI RESTRIZIONE E MAPPATURA DEL DNA
https://www.youtube.com/watch?v=gjNrpjB4Nkc
- gli enzimi di restrizione sono enzimi in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, dette siti di restrizione, formate da 4-8 coppie di basi e palindromiche (possono essere lette in entrambi i sensi mantenendo lo stesso significato)
- alcuni enzimi di restrizione operano tagli netti in entrambi i filamenti di DNA
- altri enzimi tagliano i due filamenti con lo scarto di alcuni nucleotidi, lasciando una breve sequenza di nucleotidi spaiati su ciascuna delle due estremità del taglio: queste sono dette estremità adesive, perché possono ricongiungersi sfruttando la complementarità tra le basi rimaste spaiate.
- si ottengono frammenti di DNA di lunghezze specifiche
- elettroforesi su gel --> tecnica che consente di separare acidi nucleici o proteine in base alle loro dimensioni
- il campione viene depositato su una piastra di gel di agarosio che viene poi posta in un campo elettrico, nel quale i frammenti di DNA (carichi negativamente) vengono attratti dall'elettrodo positivo.
- la matrice del gel ostacola il movimento del campione --> i frammenti più corti si muovono in essa più agilmente, mentre quelli più lunghi ne sono frenati e impiegano un tempo maggiore a percorrerla.
- così, dopo un certo tempo, i frammenti di DNA risultano distribuiti in diverse bande a seconda della loro lunghezza.
- le bande, invisibili ad occhio nudo, sono rese visibili con coloranti che si legano al DNA.
- anomalie nella sequenza del DNA portano alla modificazione dei siti di restrizione che non vengono + riconosciuti dai rispettivi enzimi di restrizione.
- conseguenza --> formazione di frammenti di lunghezza diversa da quella attesa, indicati con la sigla RFLP ("polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione")
- lo studio degli RFLP risulta utile per la diagnosi di alcune malattie genetiche
- e, confrontando la lunghezza dei frammenti derivati da una regione di DNA trattata con diverse combinazioni di enzimi di restrizione, è inoltre possibile costruire una mappa di restrizione, cioè l'insieme dei frammenti di DNA ottenuti con uno specifico enzima di restrizione
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
- il primo DNA sequenziato completamente fu quello del batteriofago phi X 174 per mezzo del "metodo Sanger" di Frederick Sanger.
- il sequenziamento Sanger si basa sul principio di complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi che compongono i filamenti del DNA.
- per determinare la sequenza esatta dei nucleotidi all'interno di un frammento di DNA si sfrutta il meccanismo replicativo --> è necessaria la presenza di un complesso enzimatico (DNA polimerasi), di specifici inneschi nucleotidici (primers), di deossiribonucleotidi trifosfato normali (dNTP) e di dideossiribonucleotidi trifosfato (ddNTP) marcati con quattro molecole fluorescenti diverse.
- viene incorporato il ddNTP che blocca il processo di replicazione e origina la formazione di numerosi frammenti che saranno analizzati poi tramite elettroforesi.
- il metodo Sanger è utilizzato ancora oggi anche se nuove metodiche, che prendono il nome di Next Generation Sequencing (NGS) sono emerse.
-
LE OMICHE
- Il Progetto Genoma Umano --> il programma di mappatura del genoma dell'uomo è stato dichiarato concluso nel 2003, nonostante mancassero ancora alcune sequenze aggiunte poi nel corso degli anni. I geni umani sono risultati essere poco più di 22.000, mentre le previsioni erano di circa 100.000. Ora bisogna capire i diversi geni con i loro meccanismi, le proteine che controllano e le loro funzioni.
- genoma = totalità del DNA presente in un organismo.
- genomica = il suo studio, sia a livello di struttura che di funzione.
- da queste due parole derivano i suffissi utilizzati anche in altre discipline biomolecolari --> definite omiche, le principali sono:
- proteomica --> studia struttura e funzione di tutte proteine codificate dal genoma umano.
- metagenomica --> studio del DNA presente in un ambiente con tecniche che si basano sul sequenziamento e l'isolamento del DNA di tutta una comunità microbica, quale può essere il microbioma intestinale (nel caso di un organo).
- trascrittomica --> analisi del trascrittoma inteso come l'insieme degli RNA messaggeri trascritti di un intero organismo o solo di una parte di esso (ES: di un organo o di una cellula in una fase del suo sviluppo).
- metabolomica --> studia il complesso di metaboliti (qualsiasi prodotto terminale o intermedio del metabolismo) presenti in un organismo in un dato momento.
- nel loro complesso, le scienze omiche sono supportate dalla bioinformatica.
-
Le regole di Chargaff
- Erwin Chargaff riuscì a separare la molecola del DNA nelle basi da cui è formata e a determinare la loro percentuale di abbondanza relativa.
- trovò delle regole fondamentali:
- esiste un rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le basi pirimidiniche (T+C) contenute nel DNA di una cellula.
- in una molecola di DNA a doppio filamento la percentuale di adenina è pari a quella di timina e la percentuale di citosina è pari a quella di guanina.
-
-
RNA
- differisce dal DNA per alcune caratteristiche:
- lo zucchero pentoso è il ribosio anziché il desossiribosio
- è costituito da un filamento singolo anziché da una doppia elica.
- contiene quattro basi azotate come quelle del DNA ma al posto della timina c'è l'uracile (U).
- è sintetizzato nel nucleo ma svolge i suoi compiti nel citoplasma.
- esistono tre tipi diversi di RNA, ciascuno dei quali partecipa alla sintesi delle proteine:
- RNA messaggero (mRNA) --> trasporta l'informazione genetica dal DNA al citoplasma, dove vengono sintetizzate le proteine.
- RNA ribosomiale (rRNA) --> è una parte integrante del ribosoma.
- RNA di trasporto (tRNA) --> trasporta gli amminoacidi liberi nel citoplasma ai ribosomi, durante la sintesi proteica, e serve per tradurre l'informazione contenuta nella sequenza di nucleotidi dell'mRNA in una sequenza di amminoacidi.
IL CODICE GENETICO
- la traduzione del messaggio contenuto nell'mRNA in una proteina (---> da linguaggio basato su 4 nucleotidi a linguaggio basato su 20 amminoacidi) è permessa da un sistema di corrispondenza, che è detto codice genetico.
- il codice è basato su triplette di nucleotidi dette codoni, che rendono possibile 64 combinazioni, più che sufficienti per codificare i 20 amminoacidi.
- il codice genetico contiene un segnale di inizio rappresentato dal codone AUG (che codifica per l'amminoacido metionina).
- contiene dei segnali di fine lettura rappresentati da tre codoni di stop (o codoni non senso).
- non è ambiguo: un dato codone specifica sempre un unico amminoacido --> ES: il codone AUU codifica sempre l'isoleucina
.
- è ridondante (o degenerato): quasi tutti gli amminoacidi sono specificati da più di un codone --> ES: l'isoleucina è codificata dai codoni AUU, AUC e AUA.
- è universale: è valido per tutti gli organismi (con pochissime eccezioni --> il DNA mitocondriale ha il codice diverso da quello nucleare, e in un piccolo gruppo di protisti i codoni UAA e UAG, anziché essere codoni di stop, codificano per l'amminoacido glutammina).
- i codoni sinonimi differiscono di solito per il terzo nucleotide
PS:
- la sintesi proteica richiede molta energia fornita dall'idrolisi dell'ATP
- via via che durante l'allungamento il ribosoma si sposta lungo l'mRNA, l'estremità 5' rimasta libera può iniziare a essere letta da un altro ribosoma --> il filamento di mRNA può essere letto contemporaneamente da più ribosomi, l'insieme dei quali è detto polisoma.
IMG_6944
IMG_6947
EREDITARIETà EPIGENETICA
- ereditata la modalità di espressione di un gene si eredita un allele trascrizionalmente attivo o meno.
-
-
NB: il plasmide F può talvolta integrarsi nella molecola di DNA principale, trasformando la cellula F+ in una cellula Hfr, anch'essa in grado di formare pili e indurre coniugazione.
Durante la coniugazione tra una cellula Hfr e una F-, insieme al plasmide F può venire trasferita anche una porzione del cromosoma batterico (DNA principale).
IMG_7117
IBRIDAZIONE
- è utilizzata per verificare se un certo gene è presente in un campione di acido nucleico o per stabilire se un gene presenta mutazioni.
- si basa sul fatto che un filamento di DNA si appaia ad un altro soltanto se il secondo filamento ha una sequenza complementare alla sua.
- una volta nota la sequenza del gene che si vuole individuare è possibile preparare delle "sonde" da utilizzare allo scopo.
- sonda --> tratto di DNA sintetizzato in laboratorio dotandolo di una sequenza di nucleotidi complementare a quella del gene target.
- IN COSA CONSISTE --> vengono separati i frammenti di DNA con l'elettroforesi su gel, le bande vengono trasferite su un foglio di nitrocellulosa o nylon e i filamenti del DNA che si forma vengono separati. Il DNA viene posto a contatto con la sonda radioattiva. Alla fine si verifica quali sono i tratti di DNA che si sono legati alla sonda e sono quindi radioattivi.
- le nuove tecniche di ibridazione usano il microarray a DNA.
REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)
- consente di produrre rapidamente un elevato numero di copie di un tratto di DNA
- replica la duplicazione del DNA e la ripete ciclicamente
- sono necessari -->
- il DNA da amplificare
- due primer complementari ai due filamenti di DNA
- una DNA polimerasi resistente alle alte temperature
- nucleotidi liberi utilizzati per la formazione dei filamenti di DNA di nuova sintesi.
- COME FUNZIONA --> 3 fasi: denaturazione --> il campione viene scaldato a 95 C per rompere i legami a idrogeno tra le basi azotate, annealing --> la temperatura viene abbassata a 40-55 C per consentire ai primer di appaiarsi al DNA, allungamento --> la temp. viene alzata a 65-72 C per permettere alla polimerasi di sintetizzare il nuovo filamento. Il processo viene ripetuto per 30-40 cicli.
- tre applicazioni della PCR rilevanti:
- consente di produrre una grande quantità di un certo gene che deve essere studiato.
- permette di ottenere l'impronta di DNA di una persona lavorando su campioni piccolissimi --> la PCR può, partendo da un campione molto piccolo, amplificarne rapidamente il DNA così da stabilire con certezza a chi appartiene il campione --> si usa nella medicina forense.
- per individuare infezioni virali in una fase molto precoce --> si riesce ad amplificare e quindi ad individuare il genoma virale anche quando sia presente in un'unica copia.
CLONAGGIO DI UN GENE
- lo scambio di materiale genetico in laboratorio si ottiene inserendo il gene di un organismo nel DNA di un altro organismo.
- la metodica è nota come ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante.
- è resa possibile dagli enzimi di restrizione --> un frammento di DNA tagliato con un determinato enzima di restrizione può unirsi a un altro frammento di DNA tagliato con lo stesso enzima, perchè i due hanno estremità adesive complementari. Le estremità adesive appaiate verranno poi saldate dalla DNA ligasi.
GENOME EDITING
- eliminare o sostituire un preciso gene in un organismo