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LAB. BIOLOGIA MOLECOLARE - Coggle Diagram
LAB. BIOLOGIA MOLECOLARE
ISOLAMENTO DEL DNA
PER RIMUOVERE E PURIFICARE IL DNA DALLE CELLULE, I RICERCATORI UTILIZZANO VARI METODI DI ESTRAZIONE DEL DNA.
PROCESSO
IL DNA DEVE QUINDI ESSERE SEPARATO DA ALTRE MOLECOLE CELLULARI,
UN METODO STANDARD DI PRECIPITAZIONE DEL DNA CONSISTE NELL'AGGIUNGERE AL CAMPIONE L'ALCOL GHIACCIATO, COME L'ETANOLO O L'ISOPROPANOLO.
LA CENTRIFUGA SEDIMENTA I DETRITI CELLULARI SUL FONDO MENTRE IL "LISATO" CONTENENTE MATERIALI CELLULARI (DNA, RNA E PROTEINE)
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LA FASE ACQUOSA CONTENENTE IL DNA NELLA PARTE SUPERIORE PUÒ QUINDI ESSERE CONVOGLIATA,
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SPESSO, SOSTANZE COME IL DETERSIVO VENGONO AGGIUNTE DURANTE LA LISI PER INTERROMPERE CHIMICAMENTE LE MEMBRANE CELLULARI A BASE DI LIPIDI,
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IN 1° LUOGO, LE CELLULE DEVONO ESSERE LISATE (APERTE)
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IL CAMPIONE VIENE QUINDI FILATO IN UNA CENTRIFUGA,
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IL PELLET VIENE LAVATO RIMUOVENDO IL LIQUIDO, LAVANDOLO NELL'ALCOOL
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DOPO IL LAVAGGIO FINALE, IL PELLET VIENE RI-SOSPESO IN UN BUFFER,
CREANDO UNA SOLUZIONE ACQUOSA DI DNA PURIFICATO CHE È PRONTO PER ESSERE STUDIATO O UTILIZZATO NELLA BIOTECNOLOGIA.
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CLONAGGIO DEL DNA
RICHIEDE VARIE FASI:
GIUNZIONE DEL DNA DA CLONARE AL VETTORE (LIGASI),INTRODUZIONE NELLA CELLULA OSPITE,SELEZIONE, MINIPREPARAZIONE DI PLASMIDI PER VERIFICA.
SCELTA E PREPARAZIONE DEL VETTORE,PREPARAZIONE DEI FRAMMENTI DI DNA DA CLONARE,
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PCR
LA PARTE NOTA DELLA SEQUENZA VIENE USATA X CREARE 2 OLIGONUCLEOTIDI SINTETICI,
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QUESTI 2 OLIGONUCLEOTIDI SINTETICI SERVIRANNO COME PUNTO D’APPOGGIO PER LA SINTESI DEL DNA,
CHE AVVIENE A OPERA DI UNO SPECIALE ENZIMA DNA POLIMERASI, LA TAQ POLIMERASI
LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) È UNA TECNICA CHE PERMETTE DI AMPLIFICARE (CIOÈ RIPRODURRE IN MOLTISSIME COPIE IDENTICHE)
UNA SPECIFICA REGIONE DI DNA,
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