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TECNICHE DI DIAGNOSTICA - GENETICA - Coggle Diagram
TECNICHE DI DIAGNOSTICA - GENETICA
(1992) FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)
SE LA SONDA SI LEGA ALLA SEQUENZA COMPLEMENTARE SUL SEGMENTO DI DNA ABBIAMO LA FLUORESCENZA.
È PIÙ PRECISA DEL CARIOTIPO.
LE VEDIAMO CON UN SEGNALE LUMINOSO.
L’IBRIDAZIONE IN SITU CON SOSTANZE FLUORESCENTI È UNA DELLE TECNICHE DELLA CITOGENETICA MOLECOLARE,
CHE PERMETTE LA LOCALIZZAZIONE DI UNA SPECIFICA SEQUENZA DI ACIDO NUCLEICO SU PREPARATI FISSATI DI CROMOSOMI METAFASICI, DI NUCLEI INTERFASICI O DI SEZIONI DI TESSUTO CON L'UTILIZZO DI UNA SONDA,
RAPPRESENTATA DAL TRATTO DI DNA COMPLEMENTARE AL TRATTO CROMOSOMICO CHE SI VUOLE EVIDENZIARE SUL VETRINO, MARCATA CON SOSTANZE FLUORESCENTI.
METTIAMO IN EVIDENZA UNA SEQUENZA SPECIFICA./
PUÒ ESSERE FATTA ANCHE IN NUCLEI IN INTERFASE
SERVE UNA CULTURA CELLULARE E CI SERVE OTTENERE UN SINGOLO FILAMENTO DI DNA CHE È LA SEQUENZA CAMPIONE DI INTERESSE
E UNA SONDA SPECIFICA OLIGONUCLEOTIDICA CHE PORTA QUESTO SEGNALE DI FLUORESCENZA.
CGH /CGH-ARRAY: COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDATION (alta risoluzione)
ENTRAMBE LE TECNICHE, CGH E CGH-ARRAY, CONSENTONO DI VALUTARE CONTEMPORANEAMENTE E CON ALTA SPECIFICITÀ PIÙ REGIONI CROMOSOMICHE
IN MODO DA POTER EVIDENZIARE SBILANCIAMENTI CROMOSOMICI.
L’EDTA È LESIVO.
RISCHIA DI ROMPERE LE CELLULE.
PUÒ PERTANTO MIGLIORARE LA FREQUENZA DI RILEVAZIONE DI PICCOLE ANOMALIE CROMOSOMICHE,
AVENDO UN LIVELLO DI RISOLUZIONE OLTRE QUELLO DEL MICROSCOPIO OTTICO (5-10 MB).
PER LA CULTURA CELLULARE SI USANO PROVETTE CON EPARINA.
PER ESTRARRE IL DNA UTILIZZO PROVETTE DI EMOCROMO CHE HANNO COME ANTICOAGULANTE L’EDTA.
CON QUESTA METODICA SI ANALIZZA LA PRESENZA DI VARIAZIONI SUBMICROSCOPICHE NEL PATRIMONIO GENETICO
E SI EFFETTUA UN MAPPAGGIO SIMULATANEO AD ALTA RISOLUZIONE DI QUESTE VARIAZIONI NELLA SEQUENZA GENOMICA.
LAVORO DIRETTAMENTE SUL DNA, NON FACCIO LA CULTURA CELLULARE
CGH-ARRAY, CHE HA UN POTERE DI RISOLUZIONE MAGGIORE RISPETTO ALLA CGH CLASSICA.
PERMETTE L’ANALISI MOLECOLARE DELL'INTERO GENOMA.
INDAGINE DI CITOGENETICA MOLECOLARE
LE INFORMAZIONI SONO QUANTITATIVE IN QUANTO IL SOFTWARE CAPTA I DIFETTI DI QUANTITÀ A LIVELLO CROMOSOMICO (BASANDOSI SU UN DNA NORMALE COME RIFERIMENTO).
NON È UN’INFORMAZIONE QUALITATIVA CIOÈ DELLA STRUTTURA DEI CROMOSOMI.
QUESTA INFORMAZIONE POSSO AVERLA SOLO DAL CARIOTIPO E DALLA FISH.
MI DA INFORMAZIONI RIGUARDO LO SBILANCIAMENTO QUANTITATIVO DEL GENOMA (DUPLICAZIONI O DELEZIONI).
MA SE C’È UNA TRASLOCAZIONE CHE È BILANCIATA, CON QUESTA TECNICA NON LA VEDO.
IL CGH ARRAY SI UTILIZZA QUANDO VI È IL SOSPETTO DI UNA SINDROME GENETICA CROMOSOMICA MA NON SO SPECIFICAMENTE DOV’È IL PROBLEMA.
IN BASE AL RISULTATO, CREO UNA SONDA SPECIFICA PER IL GENE E FACCIO LA FISH.
ANALISI DI LINKAGE (CONCATENAZIONE)
REQUISITI:
1) 1 O + FAMIGLIE IN CUI SEGREGA IL CARATTERE/MALATTIA IN QUESTIONE
2) MARCATORI GENETICI
• ALLELE + RARO CON FREQUENZA DI ALMENO 1% NELLA POPOLAZ.
• FACILMENTE TIPIZZABILI E STABILI DI GENERAZIONE IN GENERAZIONE
• POLIMORFICI -> PRESENZA DI 2 O + ALLELI ALTERNATIVI
• POSIZIONE NOTA NEL GENOMA
L’ANALISI DI LINKAGE PERMETTE DI DETERMINARE LA POSIZIONE CROMOSOMICA DI UN LOCUS RESPONSABILE DI UNA DETERMINATA MALATTIA/CARATTERE GENETICO
RISPETTO A MARCATORI POLIMORFICI LA CUI LOCALIZZAZIONE È NOTA.
MLPA (MULTIPLE LIGATION DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION)
QUESTA TECNICA SI BASA PRINCIPALMENTE SULL'UTILIZZO DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE COMPLEMENTARI A SPECIFICHE SEQUENZE GENICHE,
FORMATE OGNUNA DA 2 OLIGONUCLEOTIDI CHE SI IBRIDANO A REGIONI ADIACENTI DELLA STESSA SEQUENZA TARGET E CHE VENGONO SUCCESSIVAMENTE UNITI MEDIANTE "LIGAZIONE" ENZIMATICA
PERMETTE DI ANALIZZARE FINO A QUARANTA DIVERSE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE MEDIANTE L'IMPIEGO DI UNA SINGOLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE
POSSO TROVARE ANCHE MUTAZIONI MOLTO PICCOLE E PUNTIFORMI
INOLTRE L'OLIGONUCLEOTIDE CHE IBRIDA ALLA REGIONE AL 3' DELLA SEQUENZA TARGET E' STATO REALIZZATO IN MODO DA AVERE DIFFERENTE LUNGHEZZA X OGNI SPECIFICO TARGET,
PERMETTENDO LA FORMAZIONE DI UNA MISCELA DI PRODOTTI DI AMPLIFICAZIONE DI LUNGHEZZA VARIABILE, ANALIZZABILI MEDIANTE ELETTROFORESI
AMPLIFICAZIONE DI SEQUENZE SPECIFICHE ATTRAVERSO DELLE SONDE CHE PERMETTE DI AMPLIFICARE I SEGMENTI DI DNA E DI STUDIARLI COME SEQUENZE
TUTTE LE SONDE PRESENTANO LE STESSE SEQUENZE TERMINALI 5' E 3', CHE NE PERMETTE LA SIMULTANEA AMPLIFICAZIONE CON UN'UNICA COPPIA DI PRIMERS