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(DERIVATIZZAZIONE, il MIELE in HPLC, analisi quantitative e qualitative,…

- - - - DEREIVATIZZAZIONE IN GC
        avviene mediante trimetilclorosilano (la reazione tra questo composto e l’OH la prof la chiede), che ci permette di chiudere i gruppi idrossilici o carbossilici in modo da rendere l’analita più volatile, e quindi, più facile da analizzare in GC.
  - - - Essere univoche,** quindi non devono dare sotto prodotti.
        Questo significa se abbiamo due gruppi e non forniamo abbastanza derivatizzante, è possibile che la reazione non avvenga su entrambi i gruppi ma che si derivatizzi un solo gruppo; per tale motivo dobbiamo utilizzare un eccesso di derivatizzante, in modo da essere sicuri che entrambi i gruppi di nostro interesse vengano chiusi o legati.**
      - Essere condotte velocemente, e in questo caso la temperatura è un fattore chiave da considerare.
        La velocità della reazione può variare in modo significativo a diverse temperature.
        Ridurre il tempo di derivatizzazione a una temperatura specifica può essere vantaggioso per risparmiare tempo e ottimizzare l'efficienza del processo.
        Supponiamo che si inizi la derivatizzazione a 45°C, e con questa temperatura si richiedono 40 minuti per ottenere il 100% di derivatizzazione (resa massima) della molecola di interesse con il derivatizzante (il 100% è comunque un valore ideale che non raggiungeremo mai) .Se si decide di aumentare la temperatura a 50°C, è possibile che il tempo richiesto diminuisca a 25 minuti per ottenere lo stesso risultato.
        La scelta della temperatura è quindi una decisione critica per raggiungere la massima resa in tempi ragionevoli.
        Tuttavia, bisogna considerare che aumentare e mantenere alte temperature comporta costi significativi, sia in termini strutturali che economici.
        Ad esempio, passare da 20°C a 180°C richiede un aumento considerevole di energia e potrebbe non essere sostenibile economicamente a lungo termine, per cui il guadagno deve esserci ma per un minimo scarto di temperatura (ad esempio passando da 40°C a 50°C).
        
        Quando si sperimenta con la derivatizzazione, di solito si inizia consultando la letteratura scientifica. Se non ci sono indicazioni specifiche, vengono effettuati esperimenti a diverse temperature, ad esempio, a temperatura ambiente, 40°C, 60°C, valutando il tempo necessario per raggiungere il massimo rendimento.
        Questa ottimizzazione è fondamentale per ottenere risultati efficienti senza sprechi di tempo o risorse. Inoltre, è possibile effettuare prove preliminari con standard di recupero prima di applicare la derivatizzazione ai campioni reali.
  - - - Il tot di tempo in questione deve essere esiguo sia per non far ricompattare quello che abbiamo separato ,nel caso in cui i picchi si trovino molto vicini, sia perchè noi dobbiamo garantire una rivelazione dietro l’altra.
        La derivatizzazione post column deve essere intrinseca della strumentazione.
        La post column non è molto usata in quanto le reazioni non sono sempre molto veloci, e , per tale motivo, se abbiamo dei picchi vicini e necessitiamo di una reazione molto veloce, dobbiamo usare la pre-column.
        Nel caso dell’analisi di un’unica molecola, questo metodo va bene poichè non abbiamo un’altra molecola che deve uscire, e quindi non abbiamo la necessità di avere la separazione di differenti picchi.
        Questo approccio potrebbe richiedere una pompa ausiliaria per introdurre il derivatizzante.
        text
      - Inoltre, in questo caso, il derivatizzante non va messo troppo in eccesso, anzi va messo in egual misura in un rapporto di circa 1-1 o massimo 1-1,5.
        Questo perché noi Inoltre, in questo caso, il derivatizzante non va messo troppo in eccesso, anzi va messo in egual misura in un rapporto di circa 1-1 o massimo 1-1,5.
        Questo perché noi andiamo a trattare il campione già separato nel post column mentre nel pre column dobbiamo riuscire a derivatizzare tutto il campione, per cui necessitiamo di un quantitativo maggiore di derivatizzante.
  - - - Ad esempio, se abbiamo 30 acidi grassi che vogliamo derivatizzare useremo il pre column, magari mediante una derivatizzazione in metanolo e un’esterificazione, e poi analizziamo il tutto (in questo caso analizziamo la molecola con il derivatizzato).
        Con questo metodo si possono derivatizzare anche volumi molto esigui.
        La scelta del derivatizzante deve essere fatta con attenzione per evitare che il derivatizzante interferisca con il segnale della molecola di interesse, per cui si deve tener conto del tempo di ritenzione e della specificità verso la molecola target.
    - - Nel caso di una precolonna online, il derivatizzante reagisce con l'analita d'interesse in un sistema chiuso, dove ha il tempo di reagire a una temperatura specifica prima di passare alla pre-colonna e poi alla colonna.
      - nel caso offline la precolonna si trova al di fuori del sistema principale, all’interno di una vaialina in cui il derivatizzante è fatto reagire con l’analita in un sistema chiuso termostatato
- - - - HMF:
        Uno dei sottoprodotti della degradazione degli zuccheri, in particolare fruttosio, è l’HMF ovvero il 5’idrossimetilfurfurale, soprattutto quando aumenta la temperatura.
        Il suo valore deve essere uguale a 0 quando il miele è appena smielato. I concorsi per il miglior miele ha un limite di 10 mg/kg di questo composto.
        Andando avanti con gli anni questo prodotto di degradazione aumenta. Il limite legale deve essere minore di 40 mg/kg oppure 80 se di origine tropicale.
        
        Nel miele l’HMF è un indicatore di qualità e viene usato per capire se la produzione è stata trattata con alte temperature oppure se viene eluita a fini di vendita.
        L’aumento dell’acidità tende ad aumentare la formazione di HMF, quindi la sua concentrazione ne indica anche l’acidità del miele.
        
        È rilevante sottolineare che uno degli strumenti dell’esperienza contiene nella FM l’aceto-nitrile (ACN), che è un solvente più potente del metanolo (più apolare del metanolo) quindi esce prima; perciò, per avere lo stesso effetto delle altre FM degli strumenti si cambia le concentrazioni in acqua. In particolare, nell’AGILENT si ha l’ACN ad una conc. di H2O – ACN 95/5 mentre le altre hanno conc. di metanolo più elevate. Questo perché il potere dell’ACN è più alto del metanolo.
        
        Si lavora con un rilevatore ad UV, che utilizza una lampada al deuterio (non al tungsteno, quella è una lampada a luce visibile).
        Il monocromatore ci permette di avere la lambda migliore per poter visualizzare l’analita. Prima della misura all’HPLC ci serve sapere quale è il lambda migliore per il campione. Questo sarà messo in una cella al quarzo (ovvero la forma di vetro più pura che esista) e così si esegue uno spettrofotometro dove appariranno tutti i picchi nei quali l’assorbanza sarà elevata (o anche un picco solo).
  - - - METODO DELL'ARRICHIMENTO
        Miscela di tre composti standard di cui si conosce tr. Il campione reale ha molti più picchi dove un picco può avere un tempo di ritenzione dubbioso ovvero che non corrisponde esattamente al tr dello standard
        
        Per capire se quel picco corrisponde all’ analita noto dello standard, si aggiunge una quantità nota dell’ analita di cui siamo in dubbio.
        Per capire quanto aggiungere: Si fanno delle prove se l’analisi è qualitativa, se si fanno delle analisi in quantitativa allora si aggiunge il doppio della concentrazione dell’analita reale.
        Se ne viene aggiunto troppo allora si forma picco unico più grande che può mascherare i picchi presenti, se troppo poco il segnale non cambia
        
        Con l’aggiunta dell’analita, se nel cromatogramma il picco si ingrandisce in area allora quel picco corrisponde all’analita oppure se compare un altro picco piu piccolo allora l’analita noto non è presente nel campione.
        
        come avere maggior certezze
        
        è possibile ripetere l’analisi andando a variare sia nel campione che nello standard: la fase stazionaria o la dimensione delle particelle o la fase mobile o il sistema di rivelazione usandone uno più selettivo:
        tecniche raffinate ovvero si usa uno spettrometro di massa per essere più precisi sulla massa dell’analita di interesse perché il peso di una molecola è caratteristico di quella molecola.
        
        Oppure si possono usare composti di riferimento già presenti nel campione o aggiunti intenzionalmente come l’etanolo in GC, e vedere se i tempi dell’etanolo cambiano allora probabilmente cambiano anche i tempi dell’analita se nel campione è presente. Poi si fa il rapporto di capacità ovvero il rapporto tra il tr dell’etanolo rispetto al tr dell’analita, questo deve essere costante.
        
        L’etanolo non è un buon campione di riferimento perché il picco dell’etanolo è molto grande (troppo concentrato) e non è una gaussiana quindi è difficile risalire al tr il quale si prende al centro.
- - - - Il cromatogramma ottenuto non dà informazioni su quali composti siano presenti nella miscela analizzata (indica solo la presenza di una sostanza) e quale sia la quantità di essi.
        Un picco più alto non è detto che è rappresentativo di un campione più concentrato perché l’altezza dipende dalla sostanza e dal rivelatore, ovviamente i picchi devono rispondere in modo sensibile all’aumento della concentrazione.
        
        La determinazione della quantità̀ o della concentrazione di un soluto nella miscela analizzata o nel campione viene indicata come “Analisi quantitativa” che si basa sulla costruzione di una retta di taratura.
        prima di procedere con una quantitativa si deve fare una qualitativa
        del rivelatore viene messo in relazione con la concentrazione o con la quantità del soluto di interesse
        
        Il tempo di ritenzione primo tR’ o tempo di ritenzione corretto
        è il tempo che intercorre fra il massimo del picco di un soluto non trattenuto ovvero il tempo morto e il massimo del picco di interesse.
        tR’= tR- tM
        La colonna è associata a un cilindro, quindi, è possibile calcolare il volume morto associando l’area del cilindro.
        
        Il tempo di ritenzione non è una caratteristica fissa di un composto, ma il risultato del suo comportamento in un sistema.
        
        L'identificazione dei componenti della miscela viene detta “Analisi qualitativa”.
        Il parametro del cromatogramma che permette di identificare un composto è il tempo di ritenzione o il volume di ritenzione che deve essere correlato al tempo di ritenzione di uno standard
        
        Quindi:
        
        impiego di rivelatori selettivi
        
        riconoscimento con standard di riferimento identificazione mediante tecniche supplementari ovvero si fa una separazione si raccolgono le frazioni e si mandano al NMR
        
        tecniche raffinate più precise ovvero la massa che permette un’identificazione anche quando non c’è uno standard di riferimento
  - - - come costruite la retta:
        Il primo punto che si può prendere per fare la retta di taratura è quello stabilito dal limite di quantificazione (LOQ) ovvero dieci volte il rumore di fondo, al di sopra di quel valore si possono prendere i valori per costruire la retta
        
        Il limite di detection (LOD) ovvero tre volte il rumore di fondo, stabilisce se c’è un picco
        
        si può fare l'integrazione elettronica o metodi manuali
        
        Prima di costruire una retta, siccome l’analita di interesse deve cadere al centro, si fa uno screening iniziale facendo un confronto punto-punto che è orientativo.
        
        Se lo standard ha un‘area di 5000 e una concentrazione di 5 mg/ml e il campione reale ha un’area di 20000 non è detto che è quattro volte più concentrato perché non è detto che le relazioni sono lineari. Però si può calcolare una stima della concentrazione del campione reale facendo la proporzione: 5000: 5 = 20000: x
        
        Quindi: Si inietta un volume noto e preciso del campione e si registra il cromatogramma; poi, si prepara una soluzione a concentrazione nota del componente da determinare e si inietta lo stesso volume, registrando il cromatogramma.
        
        Metodo dello standard esterno
        :si preparano soluzioni a concentrazioni nota e scalare ovvero crescente, dello standard dell’analita di interesse. Si costruisce una retta di taratura riportando in grafico l’area dei picchi in funzione della concertazione dello standard iniettato. Si inietta il campione e dall’area del picco si risale alla sua concentrazione assoluta. La retta avrà un q quindi non passa per l’origine.
        
        Ovviamente se aumenta l’area dei picchi deve aumentare anche l’altezza .
        Si fa il bianco del solvente dove si scioglie il soluto (H2O) perché non deve avere interferenti a quella data lunghezza d’onda dove si legge l’analita.
        
        Raramente quando si fa la retta i valori sono tutti allineati quindi bisogna trovare quella migliore facendo una regressione lineare. Per capire se poi quella retta è la migliore allora si calcola il coefficiente di correlazione lineare r^2 che deve essere uguale a 1 per far si che esista una relazione lineare perfetta
        
        Se i punti sono molto disomogenei la soluzione è preparata male oppure c’è un problema nel sistema, quindi, non entra la giusta quantità nella colonna e bisogna rivedere tutto.
        
        Metodo dello standard interno:
        usato principalmente per la GC split/splitless perchè nella GC cambia ogni volta il tempo di vaporizzazione ovvero la velocità di iniezione.
        Lo standard interno si sceglie più simile all’analita di interesse e non deve essere presente nel campione reale.
        
        Si usano, per questo motivo, composti marcati o deuterati non presenti nel campione perché ha C13 o deuterio al posto dell’H, quindi, non presenti in natura. L’unico problema è che costano tanto.
        Quello che succede allo standard interno succede allo standard di interesse quindi se c’è un problemadi irriproducibilità ci sarà anche nello standard interno, in questo modo i punti sulla retta saranno più allineati.
        
        Si aggiunge una quantità di standard interno sia nel campione che nelle concentrazioni scalari dello standard dell’analita.
        Per costruire la retta si calcola il rapporto tra area dello standard e area standard interno e si riportano in grafico in funzione della concentrazione dello standard.
        
        Il rapporto A/Ais deve rimanere costante quindi la concentrazione dello standard interno deve essere sempre uguale, ma aumenta la concentrazione dello standard.
        
        Metodo delle aggiunte standard:
        si fa quando il cromatogramma è complicato, il campione è molto ricco o ci sono interferenti all’interno.
        Aliquote uguali del campione di interesse a cui si aggiungono aliquote diverse e crescenti di standard della specie da determinare.
        Sopra al campione reale, suddiviso in 5 aliquote, si fanno delle aggiunte di diverse concentrazioni, man mano crescenti
        
        Si riportano in grafico i valori di area ottenuti dalle diverse soluzioni verso le aggiunte. Ovviamente il picco dell’analita risulterà essere aumentato perché questo viene aggiunto
        
        La retta non passa per l’origine perché si parte sempre da un valore ovvero un quantitativo intrinseco del campione. Quindi avrà un q
        
        Poi per determinare la concentrazione dell’analita di interesse o prolungo la retta fino all’intercetta sull’asse x negativo, oppure traslo la retta all’origine ed estrapolo il valore
    - - Metodo manuale: si costruiscono le tangenti al picco, si forma un triangolo e si calcola l’area
      - Integrazione elettronica:
        si prende da una base all’altra del picco, se le basi vengono prese in modo diverso l’area cambia.
        Quindi i valori si fanno prendere alla stessa persona e le basi prese per calcolare l’area dello standard devono essere uguali alle basi prese nei campioni reali.
      - Non sempre è facile integrare il picco, a volte sono sovrapposti.
        Quindi si rifà l’analisi e si separano meglio oppure se non si può fare, si integra il picco prendendo in modo obliquo le basi oppure si tira giu la tangente a partire dall’avvallamento
    - - Metodo dello Standard Esterno:
        In questo metodo, viene preparata una serie di standard di concentrazioni conosciute, ognuno contenente la sostanza di interesse. La risposta strumentale (ad esempio, l'area del picco cromatografico) viene misurata per ciascuno standard. Successivamente, i risultati della curva di calibrazione vengono utilizzati per determinare la concentrazione del componente di interesse nel campione sconosciuto.
      - Metodo dello Standard Interno:
        Questo metodo prevede l'aggiunta di un composto noto (standard interno) al campione prima dell'analisi. Questo composto deve avere caratteristiche chimiche simili al componente di interesse, ma deve essere distinguibile da esso nella cromatografia.
        La quantità di standard interno aggiunto è nota, e la sua risposta strumentale viene misurata insieme a quella del componente di interesse. Il rapporto tra le risposte del componente di interesse e dello standard interno viene quindi utilizzato per calcolare la concentrazione del componente nel campioni
      - Metodo della Normalizzazione:
        In questo metodo, viene utilizzato un picco cromatografico di una sostanza interna (solvente o altro) per normalizzare la risposta strumentale del componente di interesse. Questo metodo aiuta a compensare variazioni nella risposta strumentale dovute a fattori come la variabilità nelle condizioni operative.
        
        Nel metodo della normalizzazione, si introduce una sostanza interna (IS) al campione prima dell'analisi. L'IS è un composto noto, generalmente diverso dalla sostanza di interesse, ma con proprietà fisiche e chimiche simili. L'IS deve avere un picco cromatografico ben separato da quello del componente di interesse
        .
        Preparazione del Campione:
        Si aggiunge una quantità nota della sostanza interna al campione. La quantità aggiunta deve essere accuratamente misurata.
        Analisi Cromatografica: Il campione, contenente sia la sostanza di interesse che la sostanza interna, viene iniettato nel sistema di cromatografia. Si esegue l'analisi cromatografica e si ottengono i picchi corrispondenti alle due sostanze (componente di interesse e sostanza interna).
        Risposta Strumentale: Si misurano le risposte strumentali relative ai picchi della sostanza di interesse e della sostanza interna. Queste risposte possono essere l'area sotto il picco, l'altezza del picco, o altri parametri correlati.
        Normalizzazione: La risposta strumentale del componente di interesse viene normalizzata rispetto a quella della sostanza interna. Questo può essere fatto dividendo l'area del picco del componente di interesse per l'area del picco della sostanza interna. Calcolo
        della Concentrazione: Utilizzando la curva di calibrazione della sostanza interna (costruita in modo analogo a quella del componente di interesse), è possibile calcolare la concentrazione della sostanza di interesse nel campione.
        
        Compensazione delle Variazioni Strumentali: Il metodo della normalizzazione compensa variazioni nella risposta strumentale dovute a fluttuazioni nelle condizioni operative o a piccole variazioni nella quantità di campione iniettato.
    - - Questo porta a variazione nella pendenza della retta di taratura: il picco B è maggiore del picco A perché la concentrazione è maggiore. (vedi foto)
        Il fattore di risposta si
        calcola come area del picco/ quantità iniettata e questo ci permette di costruire la retta.
- - - - La fase mobile può essere costituita da una solo fase oppure da una miscela di fasi anche completamente diverse tra loro
      - Nell’HPLC le fasi devono essere ultra-pure, le quali di solito si trovano in bottiglie ambrate, le quali vanno poi disposte in altre bottigliette gradiate (quelle celesti in foto) le quali hanno un ingresso per il tubo ed un sistema di degassamento, laddove non ci fosse nel sistema reale dell’HPLC
        
        DEGASSARE
        Le fasi mobili possono avere dell’aria e queste vanno degassate ed esistono vari modi.
        L’aria è necessaria eliminarla perché se entrasse nei sistemi creerebbe delle bolle, pressioni maggiorate e, nelle colonne molto impaccate, generare degli ostacoli che non escono più.
        
        si fa PURGE o DRAIN, ovvero far percorrere al tubo che collega la fase mobile all’iniettore la fase mobile d’interesse senza bolle, e questa operazione viene chiamata PURGE.
        
        Si apre una valvola con un alto flusso ( circa 5-10 mL/min) per riempire questi tubi così da togliere eventuale aria nella struttura.
        Tale operazione non è diretta nella colonna , perché con flusso del genere si spaccherebbe.
        Quindi, si apre la valvola del purge, che isola il comparto colonna-iniettore dal comparto pompa-fase mobile, inviando la fase mobile direttamente ad uno scarico
        
        Questa operazione deve essere fatta ogni volta che si monta una fase mobile nuova, ad esempio se devo fare un HPLC con acqua e metanolo, faccio prima di tutto il purge con una bottiglia di acqua ed una di metanolo
        
        Nelle bottiglie c’è un sistema pescante, contenente un piccolo filtro grossolano (circa 2 micron) che permette di non mandare nel sistema delle sporcizie presenti nelle fasi (anche microorganismi).
        Ogni volta che si vuole mettere una soluzione nuova, i pescanti si riempiono d’aria e quindi il purge andrebbe fatto anche quando si “rifilla” la soluzione.
      - Nelle bottiglie c’è un sistema pescante, contenente un piccolo filtro grossolano (circa 2 micron) che permette di non mandare nel sistema delle sporcizie presenti nelle fasi (anche microorganismi). Ogni volta che si vuole mettere una soluzione nuova, i pescanti si riempiono d’aria e quindi il purge andrebbe fatto anche quando si “rifilla” la soluzione.
      - Le caratteristiche dell’eluente:
        
        Devono permettere la separazione delle molecole diverse, quindi la viscosità è importante da tenere in conto, poiché maggiore è il suo valore, maggiore è la pressione con la quale si lavora
        
        Temperatura di ebollizione, una bassa temperatura di ebollizione facilita la sua rimozione anche se in questo caso in HPLC i solventi non sono così volatili quindi ci vuole molto a farli evaporare (non è una caratteristica fondamentale nelle fasi mobili per l’HPLC)
        
        Compatibili con i sistemi di rilevazione
      - Le fasi mobili devono avere certe caratteristiche:
        
        Fisiche come elevata purezza, basso costo e trasparenza ad UV (facilmente rilevabili), non devono essere corrosivi, non infiammabili ed in grado di sciogliere il campione.
        
        La forza del solvente è correlata alla polarità del solvente, l’acqua è un solvente forte in fase normale ma debole in fase inversa (dice che l’abbiamo visto mille volte). Inoltre, tale forza dipende dalla epsilon.
        
        La sua selettività dipende dalle sue caratteristiche chimiche come interazioni dipolo-dipolo, dipolo indotto… ma che siano interazioni reversibili.
        
        la degassazione è necessaria se non è presente nella struttura dell’HPLC, quelli moderni ce lo hanno tutti, quelli vecchi no.
        Il miglior modo per degassare è far gorgogliare l’elio oppure sonicarle (che costa meno dell’elio).
        
        Le bolle possono anche destabilizzare le pompe e di questo ce ne accorgiamo quando vediamo che la pressione non è stabile.
        L’elio, quando gorgoglia tende portare con le sue bolle le eventuali bolle d’aria, liberando la struttura.
        La sonicazione divide le bolle in bolle sempre più piccole così da liberarle.
        Le bolle d’aria si rilevano facilmente perché danno origine a picchi ritmici, come se intervallati, molto caratteristici tutti uguali in altezza e intensità
        
        La filtrazione non è necessaria se il solvente viene da quelle bottigliette di prima poiché sono ultra-pure,se quel liquido viene addizionato con Sali, sostanze acide e così via allora si deve fare, perché c’è il rischio di contaminazione o realizzazione di soluzioni non perfettamente omogenee, Si usano filtri da 0.5 micron i quali devono essere cambiati dopo un po’.
      - Le modalità di lavoro in HPLC sono ISOCRATICA e GRADIENTE
        
        Stessa composizione di fase mobile durante tutta la corsa (quella che usiamo noi nella esperienza con la prof), e questa è comoda poiché terminata un’analisi si può procedere con la successiva senza aspettare che la pressione ritorni ad uno stadio iniziale dopo una rampa, poiché è un unico valore.
        
        Nel gradiente, invece, la composizione varia nel tempo, ad esempio si parte da 80-20 e vai poi in 100% di metanolo e ciò implica una variazione di pressione che dovrà essere poi ristabilita a fine corsa, prima di dover reiniettare per l’analisi successiva. Questo è un vantaggio perché ci permette di analizzare più analiti contemporaneamente ma rallenta di molto le analisi
      - L’acqua può essere comprata nelle bottiglie o anche generata da degli ionizzatori che sono comporti da cartucce che permettono di togliere gli ioni più abbondanti.
        Sono collegati all’acqua corrente e attraverso questi filtri la deionizzano riducendo di molto il contenuto degli ioni permettendo di ottenere un’acqua con un sistema molto conveniente.
        Le cartucce degli deionizzatori sono dei carboni attivi che vanno sostituiti dopo un tot di tempo, in base al loro utilizzo.
        Si ottiene un’acqua con caratteristiche particolare, come una resistenza di 18,2 micro-Ohm, che è molto bassa e che identifica la ultra purezza dell’acqua, Inoltre, all’interno di questi deionizzatori possono esserci delle lampade UV per eliminare eventuali microorganismi
        
        frasi di percolo e rischio
        Sono formati da rombi rossi con all’interno delle figure che mostrano gli eventuali pericoli o avvisi
        
        il cancerogeno nella vecchia regolamentazione non c’era mentre adesso si, altri già c’erano come esplosivo, tossico, corrosivo… Inoltre, come regola fondamentale devono esserci scritte in italiano e anche in altre lingue i manuali di istruzione dell’agente chimico
        dev'essere scritto OBLIGATORIAMENTE nella lingua Se non è scritto almeno in italiano è illegale e il laboratorio può essere multato.
        
        Le frasi di rischio (R) e di sicurezza (C) sono state introdotte nella normativa europea e riguardano l’etichettatura dei prodotti chimici pericolosi.
        Sono costituite da una serie di numeri intervallati da trattini (-) o da sbarrette (/) e possono essere raggruppati a formare frasi più complesse.
        Ad ogni numero è associata una frase in un elenco che descrive il tipo di rischio e/o le procedure di sicurezza da attuare quando si maneggia quel determinato prodotto.
        
        Tipo R10 infiammabile, R 11 molto infiammabile, S1 conservare sotto chiave, S2 conservare fuori portata dei bambini e così via. Nel 2008 sono state introdotte al posto delle frasi R le frasi Hazard statements (H) e al posto delle frasi C le Precautionary statements (P) ma il concetto non cambia.
        
        in ogni laboratorio che si rispetti ci devono essere conservate delle schede di sicurezza in formato CARTACEO, così sono alla portata di tutti. Ci sono varie schede distinte all’interno di queste schede di sicurezza come gli elementi identificativi della sostanza, la sua composizione ecc.
        
        Ovviamente devono esserci dei DPI, ovvero i dispositivi di protezione individuale divisi in classi: camici, occhiali di sicurezza, guanti, mascherine (anche con i carboni attivi)
      - Le fasi mobili possono essere modificate attraverso:
        
        Tamponi per stabilizzare il pH della fase mobile sia in RPPC che in IEC
        
        Acidificatori per sopprimere la ionizzazione degli analiti acidi ed i più usati sono l’ac. fosforico e l’ac. Acetico
        
        Reagenti di coppia ionica per fare dei controioni particolare
        
        Modificatori basici per sopprimere la ionizzazione degli analiti basici
    - - SI DIVIDONO IN DUE TIPI
        
        La miscelazione ad alta pressione
        
        significa che c’è una pompa dedicata ad ogni fase mobile, ovvero che la pompa succhia la fase mobile e a valle del sistema di pompe c’è un miscelatore il quale miscela con precise % le due fasi.
        È il miscelatore che prende 80% di una fase e 20% (esempio) e si trova A VALLE delle pompe e si chiama “miscelazione ad alta pressione”, questo perché sta dopo le pompe e quindi subisce una pressione maggiore**
        
        . In quella ad alta pressione non si possono avere più di 2 fasi mobili, poiché non si possono avere più di 2 pompe (se no il sistema risulta troppo grande). ”). Questo perché ad alta pressione si ha una pompa per ogni fase mobile
        
        i miscelatori ad alta pressione
        
        Statico:
        è formato da un mixing coil, cioè un tubo di lunghezza e diametro adeguati avvolto da spire circolari che è posto tra la valvola di iniezione ed il giunto a T. è più utilizzato
        
        Dinamico:
        è come se avesse un piccolo becherino all’interno che ha un agitatore magnetico all’interno e le sue dimensioni dipendono dai flussi di lavoro
        
        La miscelazione bassa pressione
        
        La miscelazione a bassa pressione è un sistema dove il miscelatore ( o mixer) è posto prima della pompa; quindi, in questo caso c’è una pompa sola, perché la miscelazione avviene A MONTE e la pompa invia il liquido già miscelato. Ovviamente dopo che s è arrivati ad un certo mixaggio si manda tutto all’iniettore (vedremo dopo).
        
        quando si hanno tante fasi mobili siamo certi di essere in un sistema con miscelazione a bassa pressione
        
        miscelatore
        
        la miscelazione a bassa pressione avviene prima delle pompe e sono presenti delle valvole solenoidali, le quali inviano i solventi in miscelazione e poi alle pompe.
        È importante degassare e che ci siano dei sistemi di correzioni per la variazione di volume.
        
        esempio:
        se la fase mobile è MeOHACN/H2O (metanolo – acetonitrile e acqua) e sono in rapporto 35:25:40 la valvola del metanolo sarà aperta il 35% del tempo, quella dell’acido nitrile al 25% e quella dell’acqua al 40% durante il tempo per ciascun ciclo.
        è tutta una questione di valvole, ed il settaggio delle % dipende dall’apertura delle valvole.
        
        Questo perché ad alta pressione si ha una pompa per ogni fase mobile. Esistono dei microprocessori che permettono di dosare bene le % delle nostre fasi mobili con un sistema di aperture di valvole.
        Ovviamente si hanno dei limiti (non si può fare 99% / 1%) poiché esiste una quantità minima erogabile e questo dipende da quanto sia efficiente la pompa stessa (le pompe Ultra-HPLC possono fare questo rapporto, ma quelle normali no).
      - La pressione delle pompe è direttamente proporzionale alla lunghezza delle colonne alla viscosità e inversamente proporzionale all’impaccamento delle particelle, secondo la formula
      - Le pompe devono essere in grado di aspirare il solvente della bottiglia e mandarlo nella colonna.
        Perché è necessaria la pompa?
        Perché si lavora con una pressione molto alta, necessaria a contrastare l’impaccamento della colonna, di solito molto fine.
        Le pompe devono essere compatibili con i normali eluenti e chimicamente inerti e rivestiti di materiali resistenti come titanio, teflon eccetera.
        Generalmente nelle pompe di diametro intorno a 4,6 mm, l’acqua ha 10-15 milliPascal di pressione
        
        Generalmente si può arrivare a dei flussi:
        
        di 30 mL/min per colonne semipreparative (diametro di 10mm),
        
        0,5 mL/min per le colonne analitiche (diametro di 4,6mm)
        
        0,040-0,2 mL/min per microbore-narrowbore (diametro di 2,1 - 1mm).
      - Esistono 4 tipi di pompe per HPLC: Pneumatiche – Amplificazione idraulica – Siringa – Reciprocanti
        le ultiem due sono le più utilizzate
        
        POMPE RECIPROCANTI
        
        possono essere o a singola testata o a doppia testata
        Struttura della Pompa Reciprocante:
        
        una camera in cui entra il solvente. All'interno della camera, c'è un pistone che può muoversi avanti e indietro.
        Pistone e Movimento Alternato:
        
        La camma guida il movimento alternato del pistone. Quando il pistone si muove all'indietro, crea uno spazio nella camera.
        
        Microsfere di Controllo del Flusso:
        All'interno della camera, ci sono due microsfere fatte di rubidio o materiale simile. Queste microsfere controllano l'apertura e la chiusura del canale di ingresso del solvente. Quando una sfera si apre, l'altra si chiude e viceversa. Flusso del Solvente Durante il Movimento del Pistone:
        Quando il pistone va indietro, la microsfera corrispondente si alza, consentendo al solvente di fluire nella camera attraverso il canale di ingresso. Successivamente, la microsfera si chiude, isolando la camera dal canale di ingresso.
        Direzione del Flusso: Quando il pistone si muove in avanti, la microsfera opposta si apre, consentendo al liquido di fluire verso l'alto e fuori dalla camera.
        
        Nella doppia è tutto uguale solo che la camma è al centro dove i pistoni lavorano in modo opposto, una tira il liquido, l’altro lo spinge fuori.
        
        nel sistema a doppia testata quando una pompa sale l’altra scende, perché lavorano in sincronia opposta dato che il lavoro dei due pistoni è determinato dalla stessa camma.
        
        Sono caratterizzate da una camera dove entra il solvente. C’è una camma fa sì che questo pistone faccia entrare in questa camera il solvente. Tendenzialmente ci sono 2 microsfere fatte da rubidio che all’apertura e chiusura di questa pallina, chiudono e aprono il canale da dove arriva il liquido. Quando il pistone va indietro, la pallina si alza e fa entrare del liquido nella camera. Successivamente si chiuderà la pallina e quella dal lato opposto si aprirà ed il liquido passerà verso l’alto andando verso la colonna. Questo è il funzionamento della singola.
        
        Naturalmente questo funzionamento di tiraggio e spinta crea delle fluttuazione di fondo che vengono risolte nell’analisi.
        
        È importante lavare bene le pompe poiché sui cristalli si possono cristallizzare le sporcizie ed è difficile scrostarle.
        
        Esistono dei sistemi di attenuazione delle pulsazioni proprio per contrastare questo “avanti e indietro” della singola pompa grazie a delle pre-colonnine che generano delle piccole contropressioni, mentre nel sistema a doppia testa il fatto che le pompe lavorano in modo opposto l’oscillazione di fondo viene smorzata da sé.
        
        POMPA A SIRINGA
        
        è dotata da un motore asincrono associata ad una vite senza fine che si muove nel pistone e comprime il cilindro nella fase mobile (funziona come una siringa normale).
        limite rispetto a quella precedente, ovvero che si svuota ad un certo punto. Ad esempio, se la siringa fosse di 1 mL, questa spingerebbe 1 mL e poi va caricata. Un vantaggio però è che è molto precisa, e non presenta oscillazioni (non c’è il sali-scendi della pompa precedente).
        Quindi, quando si lavora con le pompe a siringa bisogna calcolare quanto dura il suo utilizzo in funzione del flusso che consuma il suo contenuto.
        
        Tendenzialmente questi tipi di siringhe vengono usate per le infusioni in massa: quando vogliamo vedere un analita nuovo ed osservare le sue caratteristiche, generalmente si usano queste pompe a siringa per via della loro precisione ed assenza di oscillazioni.
        Ultimo svantaggio: non possono essere usate in autonomia (ad esempio in un overnight) proprio per il motivo che devono essere ricaricate.
    - - è una valvola a sei vie
        La valvola a sei vie è tipicamente dell’HPLC a meno che non si parla di sistemi di introduzione dei gas particolari
        ha due modalità di lavoro
        
        Nella modalità LOAD:
        la fase mobile va sempre verso la colonna, in tutti i casi, eccetto quando si sta in PURGE (anche perché lo scopo della FM è proprio quello di andare in colonna). La FM entra in una delle 6 vie la quale è collegata solo alla colonna. Lo scopo del LOAD è inserire il nostro campione. Il campione entrerà in un tubicino chiamato LOOP, il quale, nell’immagine, unirà la 3° e la 4° via che saranno rispettivamente l’entrata e l’uscita (la 1° è per la FM, la 2° va in colonna). Il LOOP finchè non inseriamo il campione sarà vuoto (in realtà non è vuoto ma ci sarà solo la FM) e questo verrà inserito nella 5° via.
        Quindi il campione si introduce in una via (la 5°) che è collegata con l’entrata del LOOP (la 3°) e verrà riempito tutto quanto. Il campione rimane lì, fermo; ovviamente se noi carichiamo più volume rispetto a quanto ne può contenere il loop, il rimanente andrà all’ultima via, ovvero lo scarico (la 6°)
        
        Nella modalità INJECT:
        ruotando la manopola, l’entrata per il campione (la 1°) si collegherà con lo scarico (la 6°) e se si iniettasse a caricare un altro campione in modalità INJECT, verrebbe scaricato del tutto.
        Quello che è veramente importante è che la linea della FM va in controcorrente ed entrerà nel LOOP (al contrario di come è stato caricato nella modalità LOAD) e trasporterà il campione nella colonna
        
        Dunque:
        
        SE CARICO IL CAMPIONE IN MOD. INJECT -> VIENE SCARICATO
        
        SE CARICO IL CAMPIONE IN MOD. LOAD -> ENTRA NEL LOOP E RIMANE FERMO
        
        Una volta caricato il campione nel LOOP, si gira la manopola così che, trovandoci in modalità INJECT, tutto ciò che è nel LOOP verrà mandato in colonna (anche il nostro campione, dato che è stato caricato lì). È buona procedura lavare il LOOP tra un’analisi e l’altra, caricando dell’acqua pura dentro al LOOP.
    - - Serve ad allungare la vita della colonna, la quale tendenzialmente è molto più piccola della colonna ma contiene la stessa fase stazionaria della colonna scelta (se la colonna è una C18, anche la precolonna sarà C18).
        Non ha le stesse identiche caratteristiche di impaccamento della colonna, è molto più grossolana ed è per questo che costa meno, ma sono molto importanti perché tutelano la vita della colonna.
        Anziché cambiare la colonna, si cambia la precolonna, questo per almeno 2-3 volte, poi anche la colonna andrà cambiata.
    - - il modulo per la colonna puo' essere termostatatoin quel caso la T° viene mantenuta costante durante tutta l'analisi oppure no
        
        effetto della temperatura
        
        Perché la temperatura può portare dei benefici dove è omogenea durante l’analisi?
        Sicuramente perché può diminuire leggermente i tempi di ritenzione, questo perché?
        
        Perché gli analiti si ripartiscono tra fase stazionaria e fase mobile e piano piano escono, quindi questi interscambi tra fase mobile e stazionaria sono aumentano con la temperatura perché aumenta l’energia cinetica all’interno, quindi la cinetica della reazione è molto più veloce.
        
        Un altro fattore importante è la diminuzione della viscosità perché se siamo a 20°C o a 40°C la viscosità del solvente sarà diversa, l’acqua a 20°C non sarà uguale a quella a 40°C,
        la viscosità del solvente diminuisce al aumentare della T° e di conseguenza se la viscosità diminuisce aumenta, la velocità del flusso lineare è più elevata e il mio picco uscirà prima, sempre in relazione alla ripartizione tra fase stazionaria e mobile.
        
        con l’aumento T° abbiamo l’aumento della velocità di interconversione per le molecole che possono presentare diverse conformazioni, ma questo dipende molto dalla molecola.
        
        Aumento dell’efficienza perché uscendo prima il picco si stringe essendo meno tra9enuto in colonna.
        
        diminuzione dei fenomeni di adsorbimento sui siti attvi, quindi queste reazioni, fase stazionaria e fase mobile garantiscono dei fenomeni di adsorbimento inferiori e quindi i siti attvi tratterranno meno le nostre molecole.
        
        Diminuzione della stabilità delle fasi chimicamente legate
        
        bisogna anche tener conto della variabilità della T° della stanza, se la stanza è climatizzata il problema si attenua, se la colonna è in un compartimneto stabile ilmeglio ancora
        
        questo si traduce in maggiore RIPRODUCIBILITA'
      - Le colonne sono di diversa natura, possono essere impaccate in vari modi, i supporti possono essere o di silice o di polistirene.
        
        Perché si usano i polimeri invece della silice? Perché i polimeri/copolimeri sono molto più morbidi rispetto alla silice che è più compatta, inoltre la silice non viene usata con pH inferiore a 2/2,5
        
        Questi supporti devono essere poi stratificati con dei materiali/film liquidi che possono essere di varia natura a seconda della caratteristica che vogliamo dare alla nostra colonna di interesse
        
        impaccamento delle colonne:
        
        tipo di supporto: Silica (o alumina) o polimeri (polistirene reticolato)
        
        gruppi legati :- C18,C8, C4, amino, ciano e fenile - dietilaminoetil(DEAE), soldonato, ammonio quaternario
        
        la dimensione dei porti (spore) 60-300 A°-->RP/NP
        materiale con porri più grandi è usato per le biomolecole o polimeri
        area superficiale 90-400 m2/g alta area superficiale massimizza le interazione soluto siti attivi)
        
        dimensione particelle:
        
        1,8 - 3-, 5-, 7-, 10-, o 20 micron. l'efficenza è ineversamnete proporzionale a dp (diametro particelle) e la pressione della colonna è inversamente proporzionalenalle dimensione delle particelle al quadrato
        
        semipreparativa diametro 10mm
        
        analitica 4.6 mm
        
        microbore 1.0mm
        
        capillari 0.32; 0.75
        
        nano
        
        impaccate UPLC
        
        monolitiche
        
        OT
    - - dispositivi che attraverso una risposta elettrica sono in grado di mettere in evidenza i nostri analiti di interesse e a darci poi una concentrazione.
        i rilevatori si distinguono in bulk property e solute property.
        
        SOLUTE PROPERTY
        
        I solute property possono anche essere detti mass sensitive, cioè sensibili a proprietà specifiche del soluto, cioè il segnale è proporzionale alla velocità con il quale il soluto è consumato all’interno della reazione di rivelazione.
        Quindi l’area del picco è proporzionale alla quantità di soluto ed è indipendente dal flusso, quindi cambiando il flusso la forma del picco può cambiare ma l’area rimane uguale.
        
        BULK PROPERTY
        
        I bulk property possono essere detti anche flow sensitive, cioè sensibili a proprietà specifiche dell’insieme soluto-solvente.
        Quindi il segnale è proporzionale alla concentrazione del soluto nella fase mobile. L’area è proporzionale alla quantità di soluto mantenendo il flusso costante.
        L’area diminuisce all’aumentare del flusso è perciò importante mantenere un preciso controllo del flusso.
        
        possono essere universali/ selettivi
        oppure
        distruttivi/non distruttivi
        
        INDICE DI RIFRAZIONE (IR)
        
        Rivelatore universale,
        usato principalmente per componenti con attività cromoforica bassa come zuccheri, trigliceridi, acidi organici e polimeri *
        Sensibilità peggiore rispetto al rivelatore ad assorbanza (10-100 microg)
        •Sensibile a variazioni di temperatura NO GRADIENTE Dipende dal soluto e dal solvente (BULK PROPERTY)
        
        io so che quando un raggio di luce passa da una sostanza ad un altra e queste due sostanze hanno densità diverse l'angolo di rifrazione cambia
        
        Si basa e sfrutta l’indice di rifrazione che subisce un raggio di luce incidente passando per due mezzi.
        Se vediamo la cella a flusso è tagliata proprio a metà, una parte dove c’è il campione e una parte dove c’è il riferimento
        
        nel rivelatore abbiamo una lampada a tungsteno che emette una radiazione e delle len4/fenditure la mandano verso la mia cella.**.
        Le len4 e le fenditure hanno sempre lo scopo di focalizzare il mio raggio.
        Inizialmente nei due compar4 della cella faccio passare solo la fase mobile ( che ci da il bianco) e come se tarasse lo strumento e quindi azzeriamo il sistema, poi in un comparto faccio passare la fase mobile e nell’altro faccio passare il soluto (campione) con la fase mobile.
        Quindi in questo caso il mio raggio risente della presenza di due mezzi con densità diversa, quindi misura una deplezione della luce che subisce il raggio in relazione al riferimento che noi gli avevamo dato.
        la fase mobile più il campione, quel raggio verrà deviato di un certo angolo, questa si chiama rifrazione, quindi ha una deplezione rispe9o all’angolo originario.
        Questa deplezione dipende dalla quan4tà di soluto che è li dentro, quindi ci sarà più o meno deplezione a seconda di quanto è il quan4ta4vo di quell’analita.
        
        sensibile a variazioni di temperatura grande difetto di questo rivelatore, questo vuol dire che in gradiente non si può u4lizzare, quasi mai. Quindi viene usato per analisi in isocra4ca.
        
        SPETTROFOTORIMETRICO AD ASSORBANZA UV
        
        come funziona il rilevatore SPETTROFOTOMETRICO
        
        nella spettrofotometria classica il mio analita sta in questa cuvetta che si chiama statica e non a flusso, mentre nell’HPLC abbiamo la tipologia a flusso dinamico nell'HPLC il campione fluisce continuamente attraverso il rivelatore spettrofotometrico.
        
        Nella cuvetta c’è una luce incidente con una sua intensità che lo percorre da parte a parte, quindi I0 è l’intensità della radiazione incidente, I è l’intensità della radiazione trasmessa che viene poi rivelata attraverso il fotomoltiplicatore.
        Una luce incidente con intensità Io attraversa la colonna cromatografica. La quantità di luce trasmessa attraverso la colonna (intensità
        I) è influenzata dall'assorbimento da parte del campione presente nella colonna.
        
        L'assorbimento e Trasmissione:
        L'analita assorbe specifiche lunghezze d'onda della luce incidente
        . L'intensità della luce trasmessa è quindi ridotta, e ciò viene rilevato dal rivelatore spettrofotometrico.
        
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        La legge di Lambert-Beer è una legge empirica che descrive la relazione tra l'assorbanza (A), la concentrazione di una soluzione (c), la lunghezza del cammino attraverso la soluzione (b), e una costante di proporzionalità (ε), chiamata coefficiente di assorbimento molare o assorbanza molare. La formula è espressa come:
        
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        si basa sul fatto che le sostanze organiche sono in grado di assorbire l'energia sottoforma di energie elettromagnetiche e si basa sulle leggi di lambert beer
        
        lunghezza d'onda fissa
        
        È poco usato perché prevede uso di lampade specifiche per un solo elemento, quindi sono estremamente seleBve ma a una sola lunghezza d’onda.
        Quindi ad esempio monterò una lampada al mercurio, per vedere il mercurio, una lampada allo zinco per vedere lo zinco, questo perché quella radiazione è specifica per quell’elemento.
        
        Generalmente ha una cella a z (fa9a come una zeta), è a zeta per un mo4vo perché il raggio incidente passa nella lunghezza massima della cella e quindi passa dire9amente nella parte più lunga.
        
        lunghezza d'onda variabile (molto usata
        
        generalmente hanno una lampada a deuterio, delle fenditure, un ologrammatore che è un prisma o un reticolo, questo dipende molto dalla tipologia di spettrofotometro, che scompone la radiazione UV in tu9e le sue componenti e all’uscita seleziona la lambda di lavoro e la fa investire al mio analita, determinando la lunghezza d’onda.
        
        Determinerà solo una lunghezza d’onda. In alcuni HPLC abbiamo la possibilità di determinare una doppia lunghezza d’onda, quindi supportano la selezione di due lambda di lavoro, ma non di più.
        
        posso lavorare in gradiente di lunghezze d’onda, ovvero dal minuto 0,5 lavoro a 250 e dal minuto 5,8 lavoro a 280
        
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        vantaggi :
        
        versalita posso selezionare una lambda da 190 a 800nm
        
        elevata sensibilità perché posso scegliere la landa ottimale
        
        selettività quando ho la sovrapposizione di picchi si può variare la landa in modo da minimizzare l'assorbimento degli interferenti
        
        possibilità di utilizzare gradiente di eluizione
        
        Si imposta il rivelatore UV al valore di λ corrispondente al massimo di assorbimento della lunghezza d’onda per i composti di interesse. Si ottiene il cromatogramma di tutti quei composti che assorbono a quella lunghezza d’onda. Posso fare anche altre acquisizioni ad altre . Maggior selettività → λ maggiori. Minor selettività→ λpiù basse
        
        scansione rapida a serie di idoli DAD
        
        Differenza tra una lambda variabile e un DIODE ARRAY
        Viene chiamata anche ottca invertita, perché mentre in un caso a monte della cella si seleziona la radiazione di lavoro, quindi la lambda variabile, in DAD grazie ad una par4colare ottica invertita il campione e gli anali4 che arrivano dalla cella vengono investiti da tutto lo spetro delle radiazioni, che va a colpire anche un prisma/sistema disperdente che permete di acquisire uno spettro UV.
        
        Quindi nel DAD abbiamo tu9a la luce che investe il campione e poi un prisma/re4colo/policromatore che ci da tu9e le lambda di assorbimento del nostro campione che vengono raccolte e separate proprio in una serie di diodi, che sono dei colle9ori par4colari di ogni lambda.
        Qual è l’informazione differente che mi danno? Nella DAD posso vedere lo spe9ro di assorbimento della molecola, lo vedo tu9o perché tu9a la luce infrange il mio analita e rivela tu9o
        
        Il DIODE ARRAY può anche aiutarmi a capire se ho una coeluizione ovvero due o più compos4 che eluiscono con lo stesso tempo di ritenzione (analisi della purezza del picco).
        Se ho un picco e lo divido in più sezioni posso vedere lo spe9ro di assorbimento di ogni sezione e se in una sezione è presente una coeluizione vedo lo spe9ro di assorbimento che cambia.
        Per rivelare un’impurezza con un rivelatore UV visibile a lunghezza d’onda singola o variabile, sarebbe necessario individuare una spalla, una valle o un’eccessiva codatur
        
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        essa misura lo spettro d'assorbimento il campione viene attraversato da tutto lo spettro della luce e dopo viene misurato
        
        questo ti fa vederese ci sono delle coeluzioni
        quando abbiamo la sovrapposizione di due picchi. lo spettrografia della DAD è fatto tutto a righette e se per esempio tutte le line formano un onda ma una centrale si abbassa saprai che li ci sono in realtà due picchi.
        
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        Le sostanze organiche sono in grado di assorbire energia, sotto forma di radiazioni elettromagnetiche-
        L’assorbimento di energia determina il passaggio delle molecole da uno stato fondamentale ad uno stato eccitato.
        Il tipo di eccitazione dipende dalla quantità di energia associata con la radiazione. Nel nostro caso quando parliamo di UV- visibile parliamo di un range molto ampio.
        non. so se è giusto(?)
        
        l rivelatore spettrofotometrico misura l'assorbimento di radiazione elettromagnetica a diverse lunghezze d'onda. La luce incidente passa attraverso la colonna cromatografica, interagisce con il campione e il rivelatore rileva l'assorbimento in funzione della lunghezza d'onda.
        
        Nel caso del rivelatore UV in HPLC, nel momento in cui dovessero esserci bolle nel flusso, queste genererebbero dei "picchi fantasma" , che sono dati dal fatto che il raggio luminoso attraversa le bolle e non il campione, per cui sono dei picchi che non sono correlati all'analita d'interesse
        
        tipi di LAMPADE
        deuterio UV
        tungsteno visibile
        e a seconda del tipo di rilevatore (fissa variabile oDAD)
        
        preliminarmente vado ad inserire la mia sostanza dentro uno spettro fotometro per vedere a che lunghezza d'onda assorbe in modo che ci imposto sopra lo strumento anche li c'è una lampada a deuterio investe le molecola è mi restituisce lambda/assorbanza
        
         CONDUTTOMETRICO
        
         ELSD
        
         SPETTROMETRO DI MASSA
        
        ELETROCHIMICO
        
        è molto usato in cromatografia ionica.
        
        Possiede una grande sensibilità, infatti arriva all’ordine dei ppt (parti per trilione,ovvero le femtomoli), per cui ha la possibilità di misurare sia in voltammetria che in amperometria,o anche in coulomeria (raro) e in conduttimetria, che è il più usato per la cromatografia ionica.
        + Non è molto adatto per le reazioni a gradiente
        
        Caratteristiche principali:
        
        deve avere una cella conduttimetrica, che misura la conduttanza delle varie soluzioni elettrolitiche, dato che quando c’è una soluzione ionica all’interno di un solvente
        questa ha un potere elettrolitico. All’interno di questa cella sono presenti degli elettrodi che avranno una certa
        superficie e si troveranno ad una certa distanza l’uno dall’altro
        
        che rivelatore accoppiereste alla IEC?” la risposta sarà sempre il rivelatore conduttimetrico, proprio perché è tipico delle specie ioniche separate per scambio ionico.
        Poiché la miscela eluente (ovvero la fase mobile) contiene un tampone, si avrà un contributo di conducibilità della fase mobile che di solito è superiore a quello dovuto ai componenti separati.
        Quando gli elettroliti scambiati escono dalla colonna e giungono al rivelatore si avrà un incremento della conducibilità che potrà essere piccolo rispetto al valore di fondo della conducibilità della fase mobile.
        
        Saranno quindi necessari rivelatori particolarmente sofisticati che consentano di amplificare variazioni percentuali anche molto basse rispetto a un valore di fondo della conducibilità costante e piuttosto elevato.
        
        Il rivelatore conduttimetrico per eccellenza è un rivelatore elettrochimico che ha una misura conduttimetrica, ed è indicato per sostanze ioniche o ionizzabili, che sono in grado di condurre corrente.
        Questo tipo di rivelatore si usa in cromatografia a scambio ionico, per cui i nostri analiti devono essere prima ionizzati.
        Tendenzialmente è un bulk property che risente abbastanza della variazione della temperatura, motivo per cui non lavora bene sotto gradiente
        
        cromatografia a scambio ionico
        
        una singola colonna addetta allo scambio è chiamata SCIC (Single Column Ion Chromatography)
        
        utilizzano due diverse colonne in serie di cui la seconda serve per sopprimere chimicamente la conducibilità della fase mobile si parla di SIC (Suppressed Ion Chromatography).
        
        La cromatografia ionica per eccellenza basata su un conduttimetrico come rivelatore ha bisogno di due colonne a scambio ionico, per cui la modalità più usata è la SIC.
        Perchè?
        Perchè la prima colonna ci consente di attuare lo scambio ionico con lo ione di interesse, mentre la seconda colonna viene aggiunta
        per sopprimere la mobilità della fase mobile, cioè la conducibilità della fase mobile stessa che ha un alto contributo, per cui se non sottraiamo quello non vediamo più niente
        
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        schema del rilevatore
        
        1) L’iniezione del campione avviene attraverso una valvola che è tipo quella a sei vie.
        2) L’eluente è composto principalmente da idrossido di sodio (NaOH) o da carbonati, bicarbonati, e simili.
        3) La pompa del sistema trasporta l’eluente verso le colonne.
        Come possiamo vedere, la prima colonna è una colonna di separazione , mentre la seconda colonna è una colonna di soppressione.
        
        come funzionano le colonne?
        4)Per analizzare gli anioni, la prima colonna è generalmente anionica, mentre la seconda è cationica.
        In questo schema X- è il nostro analita. Dopodiché, abbiamo una resina che lega X- e rilascia un controione di interesse, come Na+HCO3-
        . Di conseguenza, la soluzione effluente sarà ricca di HCO3- o CO3-, a seconda delle condizioni (perché HCO3- deriva dalla resina a cui la fase mobile fornisce il controione)
        
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        Uscita dei picchi= Usciranno prima gli ioni piccoli e monocarica (ad esempio il Fluoro esce prima in quanto è molto più piccolo del cloro anche se hanno tutti e due la stessa carica) e poi quelli più grandi come SO4 2-.
        Quindi, la sequenza d’uscita dipenderà dalla dimensione e dalla carica degli ioni.
        Gli ioni più piccoli e leggeri usciranno prima, seguiti da quelli più grandi e pesanti.
        L'equilibrio tra H+ e X- è fondamentale per la formazione di molecole neutre. Se il legame tra H+ e X- è forte, la molecola sarà neutra e non rilevabile nella fase di rivelazione.
        
        Nel caso di un rivelatore conduttimetrico per l’analisi dei cationi, il ragionamento è più o meno lo stesso, ma in questo caso l’eluente è un HCL.
        Quindi, abbiamo i nostri analiti di interesse (Y+) e come resina SO3H+ (e da questo possiamo vedere che mentre nello schema precedente questa resina rappresentava la colonna di soppressione, ora rappresenta la colonna di separazione).
        Questa resina reagisce con gli Y+Cl- , legando l’Y+ di interesse e portando alla formazione di una grande soluzione di H+CL-. Successivamente, la resina di soppressione N+OH- (che in questo caso è anionica) lega il Cl- del nostro eluente e forma acqua.
        In questo modo possiamo vedere l’Y+ e come nel discorso precedente, Na+ uscirà prima, poi uscirà NH+ e poi molecole più grandi. text
        
        Quali sono i difetti di questa colonna di soppressione? *
        La saturazione è il difetto più grande.
        in caso di saturazione la rigenerazione della colonna è necessaria, e può essere fatta utilizzando eluenti opposti, ad esempio, se l'eluente è HCl, oppure mediante un eluente a base di NH4OH.
        Ci sono anche dei metodi di rigenerazione online che sono delle soppressioni a fibra o a membrana che però sono molto più costose.
        La rigenerazione si fa separatamente o nella stessa macchina? La rigenerazione della colonna può essere fatta separatamente utilizzando una valvola che switcha direttamente nella colonna di soppressione per non dare fastidio alla colonna di separazione.
        
        FLUORESCENZA (FL)
        
        Metodo molto selettivo, ma che ha bisogno di gruppi fluorofori che assorbono radiazioni UV a una certa lunghezza d’onda e la riemettono a una lunghezza d’onda o uguale o maggiore, non più bassa.
        Assorbono una certa lambda magari 252 e rieme9ono a 370.
        Quindi la lambda di assorbimento è diversa dalla lambda di eccitazione.
        Si lavora quindi con due monocromatori, il primo seleziona la lunghezza d’onda di eccitazione che investe la molecola, che grazie a dei gruppi cromofori specifici assorbe quella lambda e la riemette in una lambda più elevata, per questo ha bisogno di un ulteriore monocromatore.
        
        Molti composti aromatici sono fluorescenti grazie ai doppi legami e all’anello aromatico che ha un suo aspetto fluoroforo.
        Anche in questo caso più lenti ci sono più il monocromatore è seletivo e migliore è il sistema.
        Quindi il primo monocromatore serve a selezionare la lambda di eccitazione quella che il mio analita deve assorbire, il mio analita arriva alla cella di flusso dove acquisisce questa lambda che eccita il suo stato e poi tornando al suo stato fondamentale riemetterà una lambda caratieristica.
        Quello che si fa è raccogliere la radiazione a 90°, perché ci permette di eliminare tutte le componenti che hanno una certa trasmissione che non è fluorofora, quindi saranno degli interferenti che diffondono alla luce. (
        Quello che viene riemesso invece in fluorescenza quindi che a 90° riesce a mandare la radiazione al monocromatore di emissione sono solo le specie cromofore.(L’emissione per fluorescenza è misurata a 90° rispetto alla radiazione incidente)
        
        CARATTERISTICHE
        
        Non distruttivo
        
        Compatibile con i gradien4
        
        Selettivo per composti fluorescenti o resi tali à derivatizzando
        
        Poco versatile (deve essere per forza un fluoroforo)
        
        Sensibilità molto elevata 10^-9-10^-12 g
        
        Basso range dinamico lineare à si satura facilmente
        
        Poco sensibile a variazioni di temperatura, variazione della velocità di flusso
        
        cosa importati ha due monocromato
        la lunghezza d'onda a cui vengono inevstiti
        monocromatici mi selezionano una sola labbra ed io ne devo lesionare una all'ingresso ed una all'uscita
        
        RILEVATORE LIGHT SCATTERING
        
        Rivelatore che permette di superare quello che l’indice di rifrazione non fa, perché può sopportare dei gradienti
        
        È universale
        
        La fase mobile arriva dalla colonna ed entra in questa camera del rivelatore, passa poi in un capillare che è coassialmente percorso da un gas di nebulizzazione, quindi il liquido con questo gas coassiale forma questa “nebbia” di goccioline.
        Generalmente il gas utlizzato è l’azoto, in più questa camera in cui entra è una camera riscaldata, questo perme9e di togliere tu9o l’eccesso di solvente e si forma proprio uno spray misto tra goccioline ed aerosol dove è presente anche il campione di interesse.
        Il tubo essendo riscaldato perme9e anche l’evaporazione del solvente e infondo alla cella arriva il campione pulito dal solvente e incontra una radiazione emessa da una sorgente laser.
        Successivamente viene raccolta la radiazione diffusa e amplificato il segnale.
        Tutti composti che noi analizziamo anche se non hanno dei gruppi par4colari sono in grado di produrre una radiazione della luce diffusa e questa viene raccolta da un fotodiodo, amplificata e prodo9o un segnale ele9rico. Anche il questo caso la radiazione è a 60°C.
        
        CARATTERISTICHE
        
        Supera i limi4 del RI
        
        Rivela quan4tà dell’ordine del ng
        
        Non risente di variazioni di T
        
        Acce9a un ampio range di flussi
        
        Alta stabilità della linea di base
        
        Lavora anche in gradiente
        
        evaporative light scattering detector (ELSD)= Com’è fatto l’ELSD e quali vantaggi
        ha? Nebulizza il composto in una camera riscaldata in presenza di un flusso di azoto, che in genere è inerte e più puro dell’aria. Una volta nebulizzato, l'analita viene attraversato da un fascio laser e poi la radiazione diffusa viene amplificata attraverso un amplificatore grazie alla quale viene prodotto un cromatogramma.Qual è il vantaggio sostanziale dell’ELSD? Questo rivelatore non risente di variazioni di temperatura, ed è universale, ovvero va bene per tutti i tipi di composti, mentre, ad esempio, lo spettrofotometro e il fluorimetro sono rivelatori selettivi universali perché non tutte le molecole possono essere analizzate in quanto non tutte hanno dei gruppi fluorofori o cromofori (anche il rivelatore ad Indice di riflessione è universale).
        
        :CARATTERISTICHE IMPORTANTI DI UN RIVELATORE
        • Sensibilità
        • Limite di rilevabilità
        • Intervallo di linearità
        • Selettività
        
        CARATTERISTICHE DESIDERABILI IN UN RILEVATORE
        
        Ogni rivelatore ha un intervallo di linearità e la risposta aumenta linearmente ad un certo intervallo di concentrazione. Quindi all’aumentare della concentrazione aumenta anche il segnale.
        la risposta può essere lineare e non lineare
        
        iL'intervallo di linearità di un rivelatore si riferisce alla gamma di concentrazioni in cui la risposta del rivelatore è proporzionale alla concentrazione dell'analita.
        Questo significa che raddoppiando la concentrazione, il segnale raddoppierà e così via.
        la risposta non segue più una relazione lineare, ma inizia a curvarsi, si dice che il rivelatore ha un range dinamico. quando nel grafico raggiunge il plateau voldire che la risposta non è più lineare e quindi non la posso usare per la quantificazione
        Il plateau rappresenta il punto di saturazione del rivelatore, dove anche se la concentrazione dell'analita continua ad aumentare, la risposta del rivelatore rimane costante. Questo indica che il rivelatore ha raggiunto la sua capacità massima di rilevazione per quel particolare analita
        
        Il range deve essere lineare per essere il più ampio possibile, il rumore di fondo deve essere il minore possibile perché così anche il nostro LOD potrà essere più basso.Basso disturbo.
        il disturbo (noise o rumore di fondo o background) è l'oscillazione del segnale nei due sensi che può dare picchi positivi o negativi. Limita la la sensibilità del rivelatore e il LOD.
        
        Il rumore di fondo in un rivelatore si riferisce agli impulsi o alle oscillazioni casuali nel segnale del rivelatore che non sono causati dall'analita di interesse.
        Un rumore di fondo elevato può rendere difficile distinguere il segnale dell'analita da queste fluttuazioni casuali.
        Un rumore di fondo più basso significa che le fluttuazioni casuali sono ridotte al minimo, consentendo al segnale dell'analita di emergere più chiaramente dallo sfondo.
        Ciò aumenta la sensibilità del rivelatore, poiché anche piccoli segnali associati all'analita diventano più evidenti rispetto al rumore di fondo, e on questo modo è possibile abbassare anche il LOD, che rappresenta la concentrazione più bassa di un componente che può essere rilevato con precisione dal rivelatore
        
        range dinamico è il range in cui la concentrazione aumenta in modo lineare
        
        -Ampio range di linearità. La diretta proporzionalità del segnale alla concentrazione o quantità dell'analita deve coprire un ampio intervallo di valori. R=KC (10^5)
        
        Alta sensibilità, basso Limite di Rivelazione (LOD)
        e quantificazione (LOQ).
        
        Per quanto riguarda il LOD, il valore più basso di tutti lo troviamo per lo spettrometro di massa e per il riveletore conduttrimetrico o la fluorescenza, che come sappiamo arriva a concentrazioni nell’ordine dei picogrammi. Più la concentrazione è bassa, più il LOD è basso, vanno di pari passo.
        
        Uno spettro di linearità più ampio (espresso come una variabile di 10 alla quarta) indica che il rivelatore può fornire risposte accurate su un intervallo di concentrazioni molto vasto, da 1 a 10 a 1000, ad esempio.
        Ciò è particolarmente utile quando si analizzano campioni con una variabilità significativa nelle concentrazioni.
        La specificità del rivelatore è inversamente proporzionale all'ampiezza dello spettro di linearità.
        Un rivelatore specifico a concentrazioni molto basse potrebbe avere uno spettro di linearità più stretto e richiedere più attenzione nella preparazione dei campioni.
        Bisogna ricordare che ogni volta che facciamo diluizioni, concentrazioni ecc. incorriamo in errori dovuti alla manipolazione del campione.
        Più manipoliamo il campione, e maggiori sono le probabilità di avere errori legati all’operatore, come quelli associati all’utilizzo delle siringhe.
        
        Rivelatori a Cella in Flusso:
        
        Le celle in flusso sono componenti di un sistema cromatografico in cui la fase mobile (spesso una miscela di solventi) fluisce in modo continuo.
        Il "flusso" indica il movimento costante della fase mobile attraverso il sistema cromatografico. Questo flusso continuo consente un ricambio costante dei componenti della miscela, garantendo che il rivelatore riceva continuamente nuovi segmenti della miscela cromatografica.
        L'obiettivo è mantenere il volume della cella il più ridotto possibile.
        Questo perchè un volume ridotto della cella aiuta a evitare che le sostanze si diluiscano troppo o si mescolino (praticamente i componenti della fase mobile restano ben concentrati e separati l'uno dall'altro), mantenendo le bande cromatografiche strette e ben definite.
        
        Un rivelatore a cella in flusso deve essere in grado di rispondere rapidamente ai cambiamenti nella concentrazione del composto cromatografato. Questa rapidità è essenziale per acquisire segnali precisi e dettagliati, specialmente quando ci sono picchi cromatografici vicini nel tempo.
        
        Compensazione delle Variazioni di Flusso: Considerando il passaggio da una colonna ad alta pressione a un rivelatore a bassa pressione, possono verificarsi variazioni di flusso. La cella in flusso dovrebbe essere progettata per minimizzare il rischio di risentire di queste variazioni, garantendo una misurazione stabile.
        
        Le risolvo me9endo una pre colonna subito dopo il sistema di rivelazione, che fa una contropressione minima che impedisce la formazione di bolle all’interno del mio rivelatore. Che succede se ci sono bolle in un rivelatore HPLC UV? Si formano i “picchi fantasma” cosi deB, perché a volte il raggio può prendere la bolla o una cosa che non è precisamente il campion
        
        Bassa deriva. La deriva (drift) l'allontanamento della linea di base dalla linea orizzontale può essere in positivo o in negativo
        
        Alta efficienza di cella.
        Viene definita anche come la larghezza di banda strumentale. E’ determinata dalla capacità (volume) della cella.
        il volume della cella deve essere il più piccolo possibile per mantenere i componenti eluiti in bande cromatografiche strette con trascurabile effetto di diluizione e rimescolamento. Si misura in microL.