Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

HPLC, forza ionico La fase mobile eluente può contenere elettroliti forti…

- - - - Nello specifico, i siti attivi della fase stazionaria solida “legano” le molecole dei solventi e dei soluti con
        legami reversibili non polari e polari di “forza” diversa:
        1) Forze deboli (tipo Van der Waals) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo per solventi e soluti non polari;
        2) dipoli permanenti per solventi e soluti polari;
        3) legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F);
        4) interazioni dielettriche per solventi polarizzabili
      - Microparticelle sferiche di Silice porosa ;
        Particelle molto regolari con diametro uguale in tutte le particelle, i pori devono avere porosità e dimensioni molto simili perché nel momento in cui l’analita va ad interagire potrebbe rimanere “incastrato” e uscire in un tempo diverso, creando un’allargamento della banda finale.
        
        LA SILICE
        
        FF solido adsorbente comunemente vengono impiegate FF polari tipo silice, ma anche allumina Ponti silossanici I
        silossani presentano una catena principale, lineare o ramificata, in cui si alternano atomi di silicio e di ossigeno -Si-0-Si-0-
        I GRUPPI SILANOLICI = Il silanolo è il gruppo
        SI - O - H.
        
        Proprietà degli adsorbenti:
        
        Diametro delle particelle: minore è il diametro delle particelle, più veloce è il trasferimento di massa e migliore l’efficienza; il limite è costituito dalla resistenza al flusso della fase mobile.
        
        Area superficiale elevata
        
        Diametro dei pori: maggiore è la grandezza dei pori, maggiore sarà l’allargamento
        
        porosita(distribuzione dei pori). la colatura puo' comportare un minore fra due picchi. un buon assorbente presenta pori uniformi (60-120 A°) buon sviluppo superficiale e buona riproducibilità nella preparazione
        
        Attività;
        L’attività (capacità di un adsorbente di trattenere una sostanza), intesa come il complesso delle forze di attrazione che l’adsorbente esercita sul soluto:l ’attività della silice è abbastanza elevata e ciò porta ad avere dei picchi codati, fronting o tailing.
        Questo potrebbe essere modulato attraverso un aumento di temperatura liberando così più siti attivi.
        
        come rimedio può essere diminuita la temperatura, mediante aggiunta di H2O che limita la disponibilità dei siti attivi della silice, o aumentata ulteriormente per necessità di attivazione di Silice, mediante riscaldamento (in questo caso aumento di siti attivi disponibili).
        
        la Silice è un solido adsorbente prettamente per molecole polari; quindi ha un’attrazionecrescente per molecole polari;
        acidi come i –COOH saranno trattenuti con più “forza” rispetto alle olefine (per niente polari) o altre molecole meno polari. Questa è la base della Cromatografia, ovvero l’attrazione di un adsorbente con una molecola che è strettamente affine.
        
        Quindi se hanno una interazione non forte dopo quanto tempo usciranno?
        Subito... mentre se hanno interazioni più forti (comunque reversibili) come nel caso di un'ammide o di un carbossile, passeranno più tempo nella FS e servirà FM più forti per portarle via.
        E usciranno di conseguenza con tempi di ritenzione più lunghi.
        Quindi più è polare più rimane adsorbita, più è apolare, meno rimane adsorbita.
        Un altro fattore determinante è come è strutturata una molecola, ad.es. molecola con gruppi –OH in – para o in –orto.
        
        1 more item...
        
        Ha dei ponti silossanici Si-O che rendono ramificata la Silice e dei gruppi Silanolici Si-OH.
        Questa FS
        viene usata generalmente come fase polare.
        
        Perché viene impiegata come fase polare?
        Perché legano bene grazie a legami a idrogeno molecole polari, grazie ai silanoli.
        I silanoli possono anche legare molecole di H2O, in tal caso la identifichiamo come soldo adsorbente non più attivo.
        Quindi disidratiamo aumentando la
        temperatura, cosi da rompere i legami a idrogeno e riattivare la Silice adsorbente cosi da rendere questi gruppi nuovamente disponibili. Attivazione/Disattivazione Silice-adsorbente
        
        perché se arriviamo tipo a 200 gradi possiamo provocare la formazione di ponti silossanici-compatti e quindi tornare a una situazione di disattivazione, che puo’ essere risolta utilizzando un acido forte come l’HCl (riattivandola).
        sopra a 300 gradi ritroviamo quella che viene chiamata la “forma irreversibile silossanica fusa” e da qui non si puo’ riattivare, è da buttare.
        
        Un’altra problematica è data dalla reazione tra Silanoli-geminali; quindi, avere due gruppi –OH legati a un Silicio che di reazione formano un gruppo etereo, questo porta a un altro caso di disattivazione.
        Un’altra possibilità è quella dove si formano dei legami a idrogeno tra i due gruppi silossanici-terminali.
        O addrittura si puo’ arrivare ad avere una superfice silossanica fusa, che comporta una reticolazione così stretta da rendere inattiva la Silice.
        Tuttavia, la disattivazione da H2O rimane la più comune
        
        In ambiente basico/acido*
        la Silice puo’ deprotonarsi/protonarsi portando alla formazione di Si-O(-), che puo’ interagire come nuclei d’interazione secondari con i nostri analiti.
        Quindi possiamo sfruttare questa caratteristica come allo stesso tempo puo’ risultare uno svantaggio durante una basicizzazione indesiderata.
        NON deve scendere sotto il pH=2.5 e non deve salire sopra il pH=8, altrimenti non avremo più dei siti attivi funzionali.
        
        basico può protonarsi:
        
        SiOH
        -Si-O^- che possono agire come nuclei di interazione secondaria con i nostri analiti
        range PH 2-8
  - - - il legame da parte dell’adsorbente non è sempre omogeneo, in tal caso, l’analita in colonna procede ma alla fine ha una coda più lunga.
        Ciò significa che l’adsorbente trattiene molto nella FS rispetto a quello trattenuto nella FM,
        
        quindi come si può risolvere?
        Bisogna DISATTIVARE l’adsorbente con H2O, idratando quindi l’adsorbente, oppure ancora, chiudere i siti attivi dell’adsorbente (come visto per la derivatizzazione ), diminunendo l’interazione con l’analita d’interesse per poi riattivarlo nella maniera “corretta”.
        
        disattivazione dell'Adsorbente con Acqua (Idratazione):
        La disattivazione dell'adsorbente può essere realizzata idratando l'adsorbente con acqua. Questo può contribuire a saturare i siti attivi dell'adsorbente, riducendo le interazioni non desiderate tra l'adsorbente e l'analita. L'acqua può agire come "blocco" per siti attivi che potrebbero causare retrotrattenimento
        
        chiusura dei Siti Attivi (Derivatizzazione):
        La derivatizzazione dell'adsorbente è un approccio che coinvolge la modifica chimica dei siti attivi dell'adsorbente. Questa strategia può ridurre le interazioni specifiche tra l'adsorbente e l'analita. Ad esempio, se i siti attivi contengono gruppi silanolici (Si-OH) sulla superficie della fase stazionaria, questi potrebbero essere derivatizzati per ridurre l'interazione con l'acqua
    - - insolubilità nei solventi impiegati o Inerzia chimica verso gli analiti ed i solventi
  - - - Gli eluenti sono ordinati IN SERIE A POERE ELUENTE CRESCENTE base “serie eluotropica”, L valutazione dei parametri relativi ai soluti che influiscono sulla ritenzione nell'assorbimento , oltre all energie di assorbimento dei gruppi funzionali presenti nel soluto sono:
        
        le dimensioni molecolari
        
        le interazioni fra molecole di soluto
        
        il volume occunato da uno strato monomolecolare di soluto
        
        il valore di costante dielettrica
    - - Perché non possiamo inserire direttamente una % alta del solvente forte?
        Il solvente è “forte” per chi?
        Per la nostra FS-polare, se partiamo con una % di solvente forte, ci “usciranno tutte le molecole- polari (più trattenute nella FS) subito”, perché la silice lega subito tutto il solvente con cui ha più affinità.
        Questo V di fuoriuscita “troppo veloce” viene identificato come V morto, un V che passa attraverso la colonna senza subire alcuna interazione, perché appena viene adsorbito dalla Silice, viene subito sequestrato dal solvente forte.
      - adottando un atteggiamento di gradualità del solvente (da debole a forte) cosa succede?
        Cosa uscirà per primo avendo inizialmente una maggiore % di solvente debole (considerando che abbiamo molecole polari, apolari, mediamente-polari)?
        Quelle apolari (meno polari) quando il
        gradiente di solvente debole-solvente forte è inzialmente 70-30%, poi quelle mediamente-polari a gradiente di solvente 50-50% e infine quelle polari
- - - - è costituita da un liquido stratificato su un solido granulare inerte chimicamente legato ad esso.
        Inizialmente, la fase stazionaria veniva stratificata, ma a causa di problemi come il "sanguinamento" delle fasi stazionarie, si è evoluto verso l'uso di una fase stazionaria chimicamente legata a un supporto solido, spesso silice.,
        quando si lavora con pH estremi (estremamente acido/basico), si possono utilizzare copolimeri come supporto solido.
      - La fase stazionaria e la fase mobile devono essere immiscibili. Durante l'eluizione, le molecole si distribuiscono tra le due fasi in base alla loro affinità, seguendo i principi della cromatografia di ripartizione.
    - - La fase mobile essere liquida o gassosa, a seconda del tipo di cromatografia utilizzata.
        Quando si utilizza una fase mobile liquida, si parla di Liquid-Liquid Chromatography (LLC), mentre quando si utilizza una fase mobile gassosa, ci si riferisce alla Gas-Liquid Chromatography (GLC).
        
        l meccanismo che permette la ripartizione è la
        separazione della sostanza tra le due fasi liquide: fase mobile liquida e fase stazionaria liquida ovviamente immiscibili tra di loro come ad esempio le estrazioni viste in precedenza.
        I soluti migreranno tra le due fasi in base al loro coefficiente di ripartizione. Principalmente esistono due modalità di lavoro in HPLC che sono alla base della cromatografia per ripartizione:
      - Deve fornire un adeguato valore k'= Il range deve restare tra 1 e 5
        
        Deve eluire gli analiti come bande strette e gaussiane
        
        Non deve interferire con la stabilità degli analiti le rilevabilità degli analiti non devono interferire tra di loro, problema molto importante soprattutto nello spettro UV. perché se la fase mobile adsorbe alla stessa
        lunghezza d’onda dell’analita ovviamente non vedo quest’ultimo ma solo la fase mobile e non deve neanche interferire con il campione deteriorandolo.
        +Non deve interferire con la rivelabilità degli analiti
        
        Basso costo
        
        Alta purezza +Bassa tossicità
      - le fasi mobili sono una miscela di un solvente debole e un solvente forte es. acqua e metanolo
        le fasi mobili vengono divise principalmente in due gruppi; gruppo A e gruppo B;
        
        GRUPPO A
        
        il gruppo A
        è formato da composti polari come acqua distillata, acqua con acidi a pH superiori a 2 e acqua con basi a pH inferiori a 8.
        Ciò dipende sempre dal fatto che il supporto della fase fissa è la silice e quindi a volte è necessario avere fasi mobili che presentino acqua acidificata o basificata (per la legge degli equilibri acido- base) perché per raggiungere gli equilibri si ha bisogno di pH di una certa natura in modo che l’analita sia completamente indissociato e quindi avere un’unica forma di rilevazione.
        In questo caso l’acqua acidificata o basificata funge da tampone.
        Altre fasi del gruppo A sono metanolo, acetonitrile e tetraidrofurano
        
        La RP ha come fase mobile il gruppo A.
        la C18 ha come solventi il gruppo A mentre le transitorie come ciano e fenilica possono avere gruppo A e gruppo B.
        La diolica predilie il gruppo B e addirittura può essere usata anche con la SEC in cui la fase mobile è acqua pura.
        
        GRUPPO B
        
        Il gruppo B è un gruppo tendenzialmente apolare, contiene: esano, cloroformio, cloruro di metilene e alcol isopropilico. Il più apolare è l’esano.
        
        Con una normal phase abbiamo una fase stazionaria polare, partiamo quindi da una miscela contenente una percentuale maggiore di solvente apolare (che in questo caso sarà il solvente debole) per poi crescere con il solvente più polare perché la fase stazionaria è polare quindi cattura bene l’eluente. Per capire chi è il solvente forte basta pensare alla natura della fase stazionaria e quindi chi è più affine.
      - La fase mobile è formata da un solvente forte e un solvente più debole che inizialmente ha la percentuale di miscelazione maggiore che va diminuendo nel tempo lasciando spazio al solvente più forte; con più forte si intende “più forte rispetto agli analiti affini alla fase stazionaria, se si ha una fase stazionaria apolare in RP, l’acqua è il solvente debole mentre l’acetonitrile è il solvente forte perché è quello che riesce a rimuovere gli analiti che sono rimasti legati alla fase stazionaria ovvero che hanno delle caratteristiche di maggiore apolarità.
      - Quindi: la fase mobile è una miscela tra acqua distillata ed un solvente organico, eventualmente possono essere presenti anche dei tamponi che vengono utilizzati spesso quando ci troviamo nella rivelazione in massa perché si hanno bisogno di Sali per ionizzare meglio in quanto agenti agevolanti in soluzione tampone.
      - fasi mobili per la normal phase
        fasi deboli :
        
        esano eptano iso-ottanio
        fasi forti
        
        isopropanolo
        
        tetraidrofuramo
        
        cloruro di metilene
        
        Se abbiamo come fase mobile l’esano allora la fase stazionaria è polare, ad esempio isopropanolo ci troviamo in normal phase
        
        NP= fase stazionaria polare, fase mobile apolare, solvente debole esano, solvente forte isopropanolo.
      - fai mobili per fase iversa
        solvente devole
        
        aqua
        
        solvente forti
        
        acetonitrile
        
        metanolo
        
        isopropanolo
        
        tetraidrofurano
        
        Si tende a non utilizzare i clorurati perché tossici, mentre il metanolo, che è un sospetto cancerogeno continua ad essere usato in condizioni di totale sicurezza evitando lo stretto contatto soprattutto perché volatile (evapora a temperature di 67°C).
        
        l'acetonitrile e le miscele acetonitrile/acqua sono caratterizzate dalla viscosità più bassa pertanto verranno scelte come fase mobile quando è
        necessario mantenere la pressione di esercizio ai valori più bassi.
        Grazie a questa sua bassa viscosità, l'acetonitrile darà in genere l'efficienza più elevata in quanto agevola il processo di trasferimento di massa.
        Confrontando l'aceto-nitrile col metanolo, altro solvente molto usato, si sono potuti misurare incrementi di efficienza del 30% circa. Quando si impiegano miscele metanolo/acqua si incontranoaltri problemi: svolgimento di calore di miscelazione e forte tendenza della miscela a formare gas, contrazione di volume molto elevata, curva di viscosità
        
        LA VISCOSITA
        
        l’acetonitrile e la miscela di acqua e acetonitrile sono caratterizzati da una viscosità più bassa quindi il processo di trasferimento di massa è agevolato e si ottengono picchi più stretti.
        
        idealmente ci dobbiamo aspettare che aumentando il solvente meno viscoso diminuisce la pressione, in una soluzione di acetonitrile ed acqua aumentando gradualmente l’acetonitrile la pressione diminuisce linearmente.
        
        Acqua e metanolo invece hanno viscosità particolari; l’acqua è più viscosa dei solventi organici,
        nelle miscele si può comportare in modi diversi, essendo la componente più viscosa l'acqua quando nelle miscele sarà la componente maggiore (80-20%) avremo una viscosità maggiore rispetto ad una miscela 20-80%
        l’aumento della pressione non dipende solo dalla viscosità del mezzo ma anche da altri fattori quali:
        + condizioni della colonna, tipo di impaccamento, dallo strumento.
        
        Per acqua e metanolo la diminuzione non è lineare, ad una certa specifica percentuale di metanolo (circa 60-40%) si ha uno svolgimento di calore massimo nell’interazione delle due fasi che porta ad un massimo e poi un riabbassamento della pressione, perché sviluppa una quantità di energia tale da portare ad un aumento della viscosità del solvente per poi diminuire e ritornare ad una pressione molto più bassa di quella iniziale (curva ƞ).
        
        TECNICHE DI ELUIZIONE
        
        + eluizione isocratica: stessa percentuale della miscela solvente forte/debole per tutto l’arco dell’analisi
        
        eluizione a gradiente: variazione graduale della fase mobile, aumenta gradualmente la percentuale di solvente forte al minuto
        
        eluizione a gradini usata meno spesso delle precedenti, è una variazione molto brusca della percentuale della miscela forte/debole.
        
        esempio foto:
        vediamo una RP con una fase stazionaria C18 quindi altamente apolare,
        il metil-benzato è l’ultimo ad uscire perché è il più apolare quindi è quello meglio trattenuto dalla colonna.
        Vediamo che la fase mobile ha il 24% di metanolo il picco è molto lontano infatti esce dopo molto tempo, se volessi avvicinarlo andrei ad aumentare la percentuale di metanolo come avviene negli esempi sottostanti.
        Se aumentassi troppo la percentuale di metanolo i picchi combaciano tutti nel volume morto, ciò vuol dire che le molecole eluiscono dalla colonna senza nessuna separazione.
        
        La soluzione potrebbe essere procedere con l’eluizione a gradiente che consente di aumentare un po' alla volta le percentuali di metanolo ogni tot di tempo.
        In questo modo riusciamo a separare i picchi e risolverli facilmente senza finire nel volume morto (esempio: aumento di metanolo da 0 a 100% in 20 minuti).
        Se aumentiamo troppo il tempo però si avrà un picco troppo basso perdendo di sensibilità, allora si procede con un doppio gradiente ossia, fino ad un certo punto uso un gradiente con la stessa velocità e poi diminuiamo leggermente in modo da separare quei picchi che ancora restano vicini.
        Bisogna adattarsi in base a ciò che vediamo in ogni cromatogramma
        
        Abbiamo già visto che oltre agli impaccamenti in silice si possono usare anche i polimeri, generalmente polistirene e metil-benzene che hanno la caratteristica di tollerare un range di pH molto alto, quindi si può analizzare qualsiasi sostanza senza che la colonna si rovini. Hanno una buona resistenza ed una discreta rigidità. I supporti polimerici hanno la stessa funzione della silice ovvero servono come supporto sul quale sarà legata chimicamente la fase stazionaria liquida (C18, anilica, fenilica...)
        
        RP = fase stazionaria apolare, fase mobile polare, solvente debole acqua, solvente forte deve essere miscibile con l’acqua ma più apolare;
      - I solventi devono essere miscibili mentre la fase mobile deve essere immiscibile nella fase stazionaria, quindi se la fase stazionaria è polare la mobile deve essere apolare nella NP e viceversa nella RP;
        le fasi mobili si dividono in: fasi mobili deboli e fasi mobili forti, la debole è quella più polare tra le fasi mobili viste in funzione della fase stazionaria, e la forte è quella più apolare perchè va a competere meglio con l’analita.
        Ricapitolando: Il solvente debole deve essere della stessa natura della fase mobile mentre il solvente forte deve essere di natura più polare o più apolare del solvente debole a seconda se in modalità RP o NP.
    - - NORMAL PHASE (NP)  fase normale:
        fase stazionaria polare, fase mobile apolare.
        Come supporti inerti si usavano ossido di silicio, polveri di cellulosa, amido.. a cui venivano legati chimicamente fasi fisse polari, nel tempo si è passati a fasi legate chiamate: bonded phase cromatography.
        Il supporto di silice viene fatto reagire con gruppi funzionali che possono essere polari o apolari che danno le caratteristiche di polarità o apolarità alla fase stazionaria.
        È proprio il legante a determinare la natura della fase stazionaria.
        
        per essere sicuri della buona riuscita del bonded phase si fa un’ulteriore tecnica chiamata END CAPPING per schermare gli ossidrili per evitare che vadano a reagire con altri composti generando reazioni secondarie; questa tecnica non è necessaria se si usano dei leganti molto ruvidi o molto ramificati
        
        I gruppi R indicati possono essere di varia natura e di varia grandezza, possono essere metili, gruppi fenilici eccetera.
        Si sceglie il gruppo R migliore da mettere nella catena per schermare il più possibile gli ossidrili.
        Ovviamente il gruppo R principale è quello caratteristico della nostra fase stazionaria, se voglio creare una catena C18 (molto più apolare di una C8) usare necessariamente un R di 18 atomi di carbonio, mentre gi R’ possono essere di varia natura. La colonna C18 è molto utilizzata in HPLC
        
        Maggiore è il numero di carboni e più sarà apolare la fase stazionaria È POSSIBILE ANCHE LASCIARE DEI GRUPPI IDROSSILICI NON REAGITI! Ad esempio nella normal phase ci sono fasi più polari.
        
        La sua area superficiale specifica
        + La distribuzione delle dimensioni dei pori
        
        La densità dell'impiccamento :
        
        La chimica superficiale
        
        Le proprietà della silice
        
        La modifiche chimica:
        
        Il tipo di silano:
        
        La sua reattività: .
        + I gruppi funzionali (alchilici; fenilici; fluorurati, ecc.):
        
        Il corso della reazione che porta a diversi contenuti di carbonio:
        + La copertura superficiale:
        
        La concentrazione residua di silanoli
        
        End-capping: La presenza o assenza di una fase finale di blocco chimico sulla superficie del materiale.
        
        L’end capping invece ha lo scopo di ottenere una fase stazionaria totalmente apolare.
        Come vediamo dallo schema la polarità aumenta dall’alto verso il basso nelle NP, abbiamo infatti la fenilica è mediamente polare mentre l’amminica è fortemente polare In realtà la ciano e la fenilica possono lavorare ANCHE in reverse phase semplicemente andando a cambiare la fase mobile perché sono fasi intermedie
        
        la reversal phase utilizza una fase mobile polare quindi basta cambiare il solvente e lavorare in entrambe le modalità.
        
        Un solvente APOLARE ad esempio è l’esano, un solvente POLARE il metanolo, posso passare dall’esano al metanolo?
        Certo MA utilizzo un solvente miscibile sia in esano che in metanolo ad esempio l’isopropanolo che è anche molto viscoso, come prima cosa passo l’isopropanolo in colonna in modo che pulisca tutti i residui di esano e poi inietto il metanolo.
        Se una molecola è fortemente apolare utilizzo una ritenzione molto alta ( >C10).
        
        Tra il soluto e la fase stazionaria possono esserci molteplici interazioni, ovviamente deboli,affinche l’analita possa defluire dalla colonna e liberare il sito attivo (forze di Van der Waals, dipolo-dipolo, dielettriche indotte...).
        
        Le fasi più polari prevedono l'uso di solventi (FM) più apolari della FF. Tale modalità di lavoro è detta Fase Normale o Normal Phase (NP) Anche con la silice pura (LSC) si lavora in modalità NP Le fasi stazionarie fenilica, ciano e amminica possono lavorare in entrambe le modalità a seconda della FM
      - REVERSAL PHASE fase inversa: fase stazionaria apolare, fase mobile polare.
        
        Le fasi più apolari prevedono l'uso di solventi (FM) più polari della FF. Tale modalità di lavoro è detta Fase Inversa o Reversed Phase (RP)
      - NP (normale phase): Fase stazionaria → Polare; Fase mobile → Apolare
        RV (reverse phase): Fase stazionaria → Apolare; Fase mobile → Polare
        
        tipi di colonne
        
        Le colonne (FS) si classificano in base alla polarità, le più apolari soono in ordine C18,C8,C4,C2, le più polari sono quelle a Diolo (+ polare), Fenile, Cianopropile, Propilamminico.
        Le Fasi mobili più polari sono ESANO ed Eptano, Isopropanolo, un po meno polari sono Acetonitrile, Etanolo e Acqua. (LI CHIEDE)
        
        NP
        Nell’NP il solvente forte è uno polare, tipo metanolo, quello debole deve essere acqua, che non
        deve essere apolare, deve essere più apolare del polare.
        
        Nell’RP la fase mobile deve essere polare, il debole è il più polare dei solventi, il forte deve essere più polare tra i solventi ma più apolare del solvente debole.
        La fase mobile è acqua, il forte deve essere.
  - - - la repulsione che hanno nei confronti della fase stazionaria permette all’analita di camminare all’interno della colonna
        Quindi in una NP in cui la fase fissa è polare e la fase mobile è apolare, un analita polare è più affine alla fase stazionaria uscendo più tardi dalla colonna.
- - - - è un agente reticolante si mette dal 5-15% e agisce come agente reticolante, collegando le catene polimeriche e formando una struttura tridimensionale chiamata reticolo. Questo processo è noto come reticolazione
      - La reticolazione di queste resine con agenti come il divinil benzene può influenzare la capacità di scambio ionico e la selettività della colonna.
        essi possono essere funzioanlizzati
        
        La funzionalizzazione nella IEC coinvolge l'introduzione di gruppi funzionali che possono interagire selettivamente con gli ioni di interesse. Ad esempio, l'aggiunta di gruppi ammonio quaternario o solfonati può influenzare la carica della resina e la sua capacità di scambio ionico.
        
        Gruppi Ammonio Quaternario (N^+):
        
        Scambio Cationico: I gruppi ammonio quaternario (N^+) sono positivi e possono interagire con ioni negativi nella soluzione campione. Pertanto, sono utilizzati in cromatografia a scambio ionico per la separazione di cationi. La capacità della colonna di trattenere cationi specifici dipenderà dalla natura del gruppo ammonio quaternario utilizzato e dalla forza della sua interazione con i cationi.
        
        Selettività: La scelta del gruppo ammonio quaternario può essere fatta in base alla selettività desiderata. Diversi gruppi funzionali ammonio quaternario possono interagire in modo diverso con cationi specifici, consentendo la separazione selettiva di ioni simili.
        
        Controllo del pH: La capacità di regolare il pH della fase mobile influenzerà la capacità della colonna di separare cationi. Poiché il gruppo ammonio quaternario può comportarsi come una base debole, il pH della soluzione può influire sulla sua carica e sulla capacità di scambio ionico.
        
        Cationico (acido): Deboli i CBA (carbossimetil) o forti i PRS (sulfonilpropil)
        
        Scambio Anionico: I gruppi solfonati (-SO3^-) sono negativi e possono interagire con ioni positivi nella soluzione campione. Di conseguenza, sono utilizzati in cromatografia a scambio ionico per la separazione di anioni. La capacità della colonna di trattenere anioni specifici dipenderà dalla natura del gruppo solfonato utilizzato e dalla forza della sua interazione con gli anioni.
        
        Selettività: La scelta del gruppo solfonato può influire sulla selettività della colonna per determinati anioni. Diversi gruppi funzionali solfonati possono interagire in modo diverso con anioni specifici, consentendo la separazione selettiva.
        
        Controllo del pH: Anche per i gruppi solfonati, il controllo del pH è rilevante. Poiché possono comportarsi come acidi deboli, il pH della soluzione influisce sulla loro carica e sulla capacità di scambio ionico.
        
        Anionico (basico): possono essere deboli (DEA; dietilamminopropil) o forte (SAX,
        trimetilamminopropil).
        
        Si può funzionalizzare anche la silice, la formazione di una resina scambiatrice si ha dall’unione della silice con un gruppo carico (negativamente o positivamente) associato ad un controione.
        
        la scelta tra gruppi cationici e anionici dipenderà dalla natura degli ioni da separare. Se stai cercando di separare cationi, utilizzerai resine con gruppi cationici (acidi) come -SO3H, -COOH, -PhOH.
        Se stai cercando di separare anioni, utilizzerai resine con gruppi anionici (basici) come N^+(CH3)3, NH^+(CH3)2, NH2.
        È importante considerare il pH dell'ambiente in cui si sta lavorando, poiché questo influirà sulle cariche dei gruppi funzionali e, di conseguenza, sulle capacità di scambio ionico delle resine.
        
        Gruppi Acidi
        + SO3H (acido forte): Questo gruppo funzionale conferisce alle resine una natura fortemente acida. Le resine contenenti gruppi -SO3H sono ionizzate in forma -SO3^- a qualsiasi intervallo di pH, il che le rende eccellenti per la cattura di cationi in una varietà di condizioni.
        + -COOH (acido debole): Questo gruppo funzionale conferisce alle resine una natura acida, ma in modo più debole rispetto a -SO3H. Le resine contenenti gruppi -COOH tratterranno cationi in forma -COO^- in condizioni di pH basico, ma a pH acido potrebbero rilasciarli poiché il gruppo -COOH sarà prevalentemente protonato.
        + -PhOH (fenolico): Questo gruppo funzionale è debolmente acido. A pH basico, sarà in forma -PhO^- e potrebbe trattenere cationi, ma in condizioni di pH acido il gruppo -PhOH sarà prevalentemente protonato.
        
        se è in forma protonata, la resina può trattenere anioni.
        
        comprendo che tu stia descrivendo una situazione in cui si utilizza una resina cationica forte funzionalizzata con gruppi -SO3^- in una colonna di cromatografia a scambio ionico per separare ioni cationici di interesse. L'idea di base è quella di utilizzare un controione più piccolo e meno complesso, come l'ione H+, per competere con il controione originale della resina, in modo da favorire l'eluzione dell'analita di interesse.
        
        esempio
        
        Resina Cationica Forte: La resina è funzionalizzata con gruppi -SO3^-, conferendole una carica negativa. Questa resina sarà in grado di trattenere ioni cationici (positivi) grazie all'attrazione elettrostatica tra i gruppi -SO3^- della resina e gli ioni cationici.
        
        Controione Originale: Inizialmente, la resina avrà un controione associato (per esempio, Na+ o un altro ione metallico). Questo controione è "sostituibile" e può essere rimpiazzato da un altro ione cationico, compresa la specie di interesse.
        
        Competizione per il Controione: Quando si passa attraverso la colonna la miscela di ioni cationici, il controione presente sulla resina può essere "sobbalzato" o scambiato con l'analita di interesse. La competizione avviene tra l'analita cationico e il controione originale della resina.
        
        Scelta del Controione Aggiunto (Eluente): Per favorire il processo di eluizione dell'analita, si utilizza un controione più piccolo e meno complesso, spesso l'ione H+ (proveniente da una soluzione acida). Gli ioni H+ competono con il controione originale sulla resina e hanno maggiore facilità di eluizione.
        
        Eluizione dell'Analita: Quando gli ioni H+ si sostituiscono con successo con il controione originale sulla resina, l'analita di interesse viene rilasciata dalla colonna. La soluzione eluita contiene quindi l'analita di interesse e l'acido aggiunto contribuisce ad acidificare la soluzione.
        
        1 more item...
        
        Gruppi Basici:
        + N^+(CH3)3 (basico forte): Questo gruppo funzionale conferisce alle resine una natura fortemente basica. Le resine contenenti gruppi N^+(CH3)3 saranno cariche positivamente (N^+(CH3)3) per qualsiasi intervallo di pH, rendendole eccellenti per la cattura di anioni in una varietà di condizioni.
        
        NH^+(CH3)2 (basico): Questo gruppo funzionale è basico, ma in modo meno pronunciato rispetto al N^+(CH3)3. Le resine contenenti gruppi NH^+(CH3)2 saranno cariche positivamente a pH acido e possono rilasciare protoni a pH basico.
        +NH2 (basico debole): Le resine contenenti gruppi NH2 saranno cariche positivamente (NH3) a pH acido. Aumentando il pH, la forma protonata NH2 può rilasciare protoni e diventare neutra (NH2).
        
        Le resine forti scambiano per qualunque valore di Ph, quelle deboli solo per dei range di Ph. Le
        cationiche contengono un gruppo di natura acida, le anioniche un gruppo di natura basica.
    - - La fase mobile nello scambio ionico deve possedere delle caratteristiche, sciogliere il campione, avere potere solvatante tale da dare k ragionevoli, interagire con i soluti in modo da avere selettività conveniente
    - - Nel processo di scambio ionico, l'affinità di uno ione per una resina di segno opposto dipende da diversi fattori:
        
        Carica dello ione: Maggiore è la carica dello ione, maggiore è l'affinità per la resina. Ad esempio, cationi con cariche più elevate tendono ad avere un'attrazione più forte verso la resina di segno opposto.
        
        Dimensione dello ione: La dimensione dello ione influisce sulla sua capacità di essere trattenuto dalla resina. I ioni più grandi hanno una maggiore capacità di essere trattenuti dalla fase stazionaria.
        
        Solvatazione degli ioni: La solvatazione degli ioni, ovvero la presenza di molecole d'acqua che li circondano formando una sfera di solvatazione, può influenzare l'affinità per la resina. Maggiore è la sfera di solvatazione, minore è l'attrazione per la resina.
        
        Un esempio pratico di questo principio si verifica nelle bevande spiritose, dove ioni come il potassio (K+) e il sodio (Na+) hanno una carica singola positiva, mentre ioni come il magnesio (Mg2+) e il calcio (Ca2+) hanno cariche doppie positive.
        Nella cromatografia ionica, prima escono i cationi singolarmente carichi, poi quelli con cariche doppie, poiché sono più fortemente trattenuti.
        La differenza di grandezza degli ioni contribuisce
        ulteriormente alla sequenza di eluizione.
        Ad esempio il calcio pur avendo stessa carica del Magnesio esce dopo in quanto èpiù grande del Mg quindi viene trattenuto ai più
  - - - si può agire su 3 diversi parametri,
        
        Il pH può influenzare sia la carica della resina, qualora si tratti di resine deboli, o la carica degli analiti qualora si tratti di analiti acidi o basici sia PER LA RITENZIONE CHE PER L'ELUIZIONE Una volta che la forma dissociata si è legata alla resina, per eluire bisogna far tornare l’acido alla
        forma indissociata abbassando il PH di 2 unità rispetto al PKA
        
        R-COOH--><--- RCOO- + H+ ritenzione pH>pKa
        elusione pH< pKa di almeno due unita
        Abbassiamo il ph per far sì che si riporti l’equilibro nella forma indissociata, l’analita di interesse
        migrerà da solo dal sito attivo.
        
        SOLVETI ORGANICI
        La fase mobile eluente può contenere piccole percentuali di solvente organico, miscibile con H 2 O, per abbassare la costante dielettrica del mezzo e per inibire eventuali interazioni secondarie con la fase stazionaria.
- - - - 3 zone:
        
        zona di esclusione totale = molecole troppo grandi escono tutti assieme 1° picco
        
        zona di perfezione selettiva= dove avviene la separazione
        
        zona permaziazione totale quando le molecole sono troppo piccole escono tutte assume ultimo picco
        
        Devo sempre partire da degli standard per tarare lo strumento, e scegliere i pori della dimensione giusta per tenere le mie molecole di interesse nella zona di permeazione selettiva.
        Kdv= coefficiente distribuzione volumetrica.
        
        Si lavora a bassi flussi, pressione di lavoro più bassa rispetto a LC di ripartizione, risoluzione scarsa.
        Si usa a scopi preparativi.
        Generalmente le colonne sono in vetro, quelle con materiali soft non supportano tante pressioni possono andare in contro a frammentazioni.
        Le colonne vengono spesso mantenute in etanolo, si usano fasi organiche e inibisce la crescita batterica.
        
        Per calcolare la distribuzione dei pesi molecolari si fa una retta di taratura di molecole a peso molecolare noto, la retta va verso il basso perché > è il peso molecolare < è il tempo di ritenzione, quando abbiamo un polimero
        questo ha una distribuzione di pesi molecolari e il picco si presenta abbastanza allargato, giocando con i pori ci permette di caratterizzarlo in base al K in uscita dalla nostra colonna
        
        Ogni fase stazionaria è caratterizzata da un grafico di permeazione, le fasi
        fisse per la permeazione su gel possono essere di diversi materia
        
        Rigidi: ci sono anche palline di vetro porose, silice porose, silice diolo. Si usano fasi acquose o organiche
        
        Semirigidi o soft:
        Sono polimeri a base di stirene e divinilbenzene o poliacrilammide, per quelli soft si chiamano SEPHADEX, che si dividono in destrano o destrano sostituito silanizzato, sono zuccheri molto soft e si allargano o si restringono con molta o poca acqua. Si utilizzano fasi acquose.
        
        Che vantaggio hanno i soft rispetto alle rigide?
        il guadagno principale è l’utilizzo di pompe, in quelle rigide servono pompe molto più forti rispetto alle soft che però possono perdere in efficienza a lungo andare anche se creano meno fratture interne
        
        La fase mobile è una fase di trasporto non interagisce con gli analiti, ma la scelta dipende dalla solubilità del campione in essa e dalla sua compatibilità con la fase stazionaria. Questi tipi di SEC si fanno per molecole polari o con l’intervento di solventi organici riusciamo a tamponare la situazione
        
        In SEC/GPC, è necessaria una sola pompa poiché la viscosità dell'eluente va mantenuta costante
        e quindi non si usano gradienti di solventi (no interazione tra analita e FS).
        
        A volte si usano sali inorganici per evitare interazioni ioniche(interazioni secondarie) con la fase stazionaria, o modificatori organici per evitare interazioni idrofobiche con la fase stazionaria.
- - - - LC;
        ha unacolonna di vetro impaccata con una FS, presenta setti di
        purificazione fatti di lana di vetro, che serve per evitare di far andare molecole con una certa granulometria elevata nel nostro liquido (processo di purificazione), fase eluente ovvero il liquido che percola tutta la colonna e separerà il liquido in base al loro Kd.
      - HPLC
        non abbiamo un percolante, ma c’è una vera e propria pompa, che fa in modo che la FM venga succhiata con un certo flusso e mandata in alta pressione all’interno di un compatto-colonna che ha caratteristiche di impaccamento migliori rispetto a una colonna impaccata a mano (LC).
        
        differenze:
        è che la FM non passa più per gravità ma attraverso delle pompe.
        Altre differenze sostanziali sono che nella LC, le velocità di flusso sono basse e i tempi di ritenzione lunghi, caso inverso nella HPLC, motivo per il quale puo’ presentarsi il fenomeno di retropressione,
        altra differenza è che la LC è costituita da una colonna in vetro, in quanto non subisce chissà che pressione, mentre nell’HPLC, soggetta ad alte pressioni, vengono usate colonne e materiali costituiti da un impaccamento molto più fine
        
        Colonne con dm<1mm, il dm max raggiungibile è 4.6 mm.
        
        Materiale impaccante molto fine di 1.8-10 µm.
        
        Sistema di gestione per il controllo della velocità della FM.
        
        Rilevatori on-line, che ci permettono di cercare online l’analita, appena esce dalla colonna.
        
        Strumentazioni automatizzate, quindi la possibilità di separare anche 24h/24.
        
        Colonne HPLC.
        La colonna è costituita da un tubo in acciaio che offre un buon equilibrio fra la resistenza alla corrosione (in quanto possono essere usati anche additivi acidi all’interno delle FM), alta pressione, tipologia di impaccamento e costo.
        In particolari applicazioni, dove è richiesta una elevata inerzia chimica, l’interno è rivestito con delle resine (PEEK), o altro materiale inerte, la superficie è perfettamente levigata e con bordi finemente rifiniti.
        
        il dm e la lunghezza sono dettagli da scegliere in base al tipo di applicazione (analisi in tracce, metaboliti, analiti principali, dobbiamo risparmiare solventi? Etc...).
        Le più usate nella ricerca sono le “Narrow-bore” che rispetto alle “Microbore” si differenziano per il dm interno
        
        Come scegliere una lunghezza? Posso trovarmi in due situazioni:
        
        L’analita esce molto presto quindi non serve avere una colonna di 250 mm (ad.es), che comporta un impiego di solventi, tempo, costi etc...
        
        Se ho invece analiti che escono “tutti assieme”, con tempi molto vicini fra loro, allora devo considerare una colonna più lunga, perché la risoluzione risente del numero di piatti teorici, quindi meglio averne di più.
        
        Retro Pressione (Back Pressure):
        In HPLC, l'uso di pompe ad alta pressione permette l'impiego di velocità di flusso elevate attraverso la colonna di cromatografia.
        Questo comporta la necessità di superare la resistenza al flusso offerta dalle particelle di stazionamento della colonna.
        La retro pressione è la resistenza che il sistema di HPLC deve superare per mantenere il flusso del solvente attraverso la colonna.
        Quando si lavora con particelle di stazionamento più piccole (comunemente nella gamma submicrometrica) e velocità di flusso elevate, la retro pressione aumenta.
        
        PIù allunghiamo la colonna, più aumenta il numero di piatti teorici...tuttavia la retropressione aumenta, per questo si passa da una HPLC ad un’ultra-HPLC che sopporta pressioni ancora più elevate.
        Quando ci riferiamo ala retropressione è da intendere come un aumento sproporzionato nel pompaggio del fluido che ostacola il passaggio del fluido stesso, essa è inversamente proporzionale al dm delle particelle, al raggio della colonna e alla permeabilità specifica del liquido
        
        necessitiamo di un equilibrio tra la lunghezza delle colonne e i sistemi di pompaggio.
        
        l'esempio dell' isopropanolo la FM più viscosa di cui abbiamo parlato. tra l'uso del metanolo o isopropanolo la retropressione cambierà completamente
        
        Fattori determinanti l’impaccamento?
        
        • Diffusione longitudinale (Termine B nell’equazione di Van Deemter):
        si riferisce alla dispersione dei soluti lungo la colonna cromatografica dovuta al movimento casuale delle
        molecole del solvente mobile.
        Una diffusione longitudinale elevata può portare a una dispersione dei picchi cromatografici, riducendo la risoluzione della separazione. Le molecole della sostanza diffondono sia nella fase mobile sia in quella stazionaria. Tendono cioè a passare spontaneamente da zone a concentrazione più alta a quelle a concentrazione più bassa secondo una direzione longitudinale, quella appunto di avanzamento della fase mobile.
        
        ale fenomento è più marcato in GC che in HPLC? E’ più diffusa in GC, in
        quanto i gas hanno più libertà di movimento.
        
        Qual è il fattore che determina più in assoluto una migliore risoluzione in GC piuttosto che in HPLC? Quale fattore non è presente in GC (almeno nelle colonne capillari)?
        La resistenza al trasferimento di massa in HPLC è più marcato, in quanto in GC non c’è l’impaccamento delle colonne.
        
        La resistenza al trasferimento di massa (Termine C nell’equazione di Van Deemter):
        E’ la resistenza per cui alcune molecole viaggiano più velocemente nella fase mobile ed alcune rimangono più tempo “bloccate” nella fase stazionaria ed è il motivo del ritardo della fuoriuscita dell’analita causando l’allargamento del picco.
        Se questa resistenza è troppo alta, influisce negativamente sull'efficienza della separazione.
        Si puo’ ovviare a questa dinamica diminuendo le velocità di flusso.
        
        Percorsi Multipli:
        Se ci sono differenze nell’impaccamento delle colonne avrò un allargamento dei picchi, in quanto alcuni analiti passeranno più facilmente o più difficilmente causando un allargamento.
        La soluzione migliore è quella di usare granuli quanto più omogenei possibili e dimensioni non tali da causare problemi all’apparecchiatura cromatografica, rispettando queste caratteristiche si può avere la relativa certezza che le particelle utilizzeranno quasi lo stesso tempo per uscire e si minimizza il naturale allargamento della banda.
        
        Se ho degli impaccamenti più fini avrò una risoluzione migliore o peggiore dei picchi cromatografici?
        Migliore. Infatti se userò una microbore avrò una risoluzione migliore rispetto a una colonna analitica.
        
        Per quanto riguarda la curva di Van Deemter, al diminuire del dm e
        quindi all’aumentare dell’impaccamento della colonna, la curva shifta verso un andamento sempre più basso.
        quindi scende il minimo delitto teorico e al diminuire del diametro esservo un braccio destro dell curva meno ripido
        aumento ala destro pressione
        
        Cosa rappresenta quell’abbassamento di curva?
        Che c’è un minimo di piatto teorico molto più basso, quindi una maggiore efficienza della colonna.
        Ricordate cosa rappresenta questa curva che va quasi parallela?
        Che all’aumentare della velocità resta sempre costante il numero di piatti teorici, e quindi una migliore efficienza.
        Tuttavia la retropressione è sempre presente, quindi si diminuire le particelle, aumentiamo la colonna ma fino ad una certa.
        
        L'allargamento della banda altri sottofattori o contributi:
        
        Volumi morti e Dispersione del soluto nel sistema d’induzione (Wj): quanto più sono
        presenti V morti, tanto più abbiamo un allargamento della banda e una retropressione.
        
        Connessioni (Wf): più lunghe sono queste connessioni (guarnizioni) più avrò retropressione e quindi la banda si allunga, per questo motivo devo cercare di avere delle connessioni il più strette possibili.
        
        Tubazioni capillari (We): lunghezza da iniettore a colonne e al rivelatore.
        
        Sistema di Rivelazione (Wd): dal numero di celle presenti
        
        Impaccamento della colonna (Wc): considerazioni fatte precedentemente W2 T = W2 J + W2 F + W2 E + W2 D + W2 C dove WT = larghezza della banda totale
        
        Dunque, l'obiettivo è minimizzare tutti questi fattori che determinano i cosiddetti “V extra-colonna".