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Nucléotides et acides nucléiques : struct, fonct° et caractérisat° -…

- - - - acides nucléiques formés à partir de bêta-D (désoxy)ribofuranose
    - - concept° de syst artificiels
        
        mol bio-orthogonales (biologie de synth)
        
        résistances aux enz de dégradat°
    - - seuls 4 des 5 atomes du cycle sont ds plan
  - - - adénine +bêtaD-Ribose = adénosine + H2O
  - - - pyrimidine (cycle 6 avc N en 1 et 3)
        
        cytosine (O en C2 et NH2 en C4)
        
        O en C2, O en C4 et CH3 en C5)
        
        uracile (O en C2 et C4)
      - purine (pyrimidine et cycle à 5 avc N en 7 et 9)
        
        adénine (NH2 en C6)
        
        guanine (O en C6 et NH2 en C2)
      - résonnance de dlbes liaisons
      - cycle plans ou quasi plans
    - - isomérisat° dépendant du pH (mouv H)
        
        fonct° amide devient fonct° énol
        
        forme lactame dom à pH physio
    - - formes lactames et amino dom à pH 7
      - tautomérisat° modifie capacité intéract°
      - conséq
        
        implicat° possible ds reconnaissance et catalyse par ARN
        
        génère erreurs de traduct° (reconnaissance codon/anticodon erronée)
    - - pseudouridine (phi) et ses dérivées
      - majoritairemt ds ARNr et ARNt
  - - - liaison anhydride (acide + acide)
      - ester (alcool + acide)
  - - - ATP
        
        dégradat° par ATPases
        
        E des hélicases (réplicat° ADN)
        
        E des transporteurs membranaires (pompe Na/K)
      - GTP
        
        dégradat° par GTPases
        
        E du ribosome (traduct°)
        
        E pr transport nucléaire (Ran)
        
        RanGTPase (protéine) sépare cargo de son transporteur lorsque complexe a atteint par diffus°, l'extrémité nucléaire du pore
    - - augmenter/diminuer glucose
      - AMPc
        
        activat° de l'express° des gènes du métabolisme des sucres
      - (p)ppGpp (alarmone)
      - co-facteurs enz (co-enz)
        
        voie des pentoses phosphates
- - - - extrémité 5' : phosphate
      - extrémité 3' : OH
  - - - pH = pKa + log (A-/AH)
    - - bromure d'éthidium
  - - - liaisons directe
      - ou médiée (H2O, métal)
      - empilemt de bases
        
        act° complémentaire aux liaisons H
        
        intéract° par force de Van der Waals
- - - - règle de Chargaff établies par dosage chim
        
        adénine = thymidine
        
        guanine = cytosine
        
        purine = pyrimidine (A+ G = C + T=
    - - démontre une organisat° hélicoïdale ADN à 2 périodes
    - - 1er modèle erroné : ne rend pas compte règles de Chargaff
    - - dist entre C1' liaisons N-glycosidiques
    - - isostérie = pb de "formes" semblables
      - pb cis empilable avc maintien posit° C1'
      - paires W-C cis permettent régulat° hélice
      - impossible avc paires W-C trans
    - - chaînes anti// et complémentaires
    - - pas hélice
      - angle de rotat°
      - env 10,5 pb par tour d'hélice
      - bases s'empilent en partie (stabilisat°)
    - - empilemt pb réduit capacité absrobance
        
        réduct° absorbance à 260 nm
        
        effet réversible par dénaturat° (fonte) ADN dble brin par act°
        
        agt alcalin (élimine liaisons H)
        
        T°
        
        restitut° absorbance = effet hyperchrome
        
        fonte/stabilité hélice ADN quantifiée par T° fus°
        
        T° fus° = T° à lq moitié ADN sous forme simple brin
    - - 2 liaisons H entre A et T
      - 3 liaisons H entre G et C
    - - purines peuvent ê syn ou anti
      - pyrimidines uniqumt anti car clash stérique entre C2 O et sucre
    - - forme A induite par déshydrat°
      - forme Z adoptée par alternance purine/pyrimidine
    - - attachemt symétrique bases au ribose
        
        format° 2 sillions identiques
      - attachemt asymétrique des bases au riboses
        
        format° de 2 sillions de largueurs différents
        
        sillon majeur : 12 A°
        
        sillion mineur : 6 A°
    - - reconnaissance base-spé se fait préferentiellemt par sillon majeur
    - - reconnaissance entre ARN poly T7 et son promoteur
      - reconnaissance par prot pr
        
        transcrire ADN en ARN (ARN poly)
        
        réguler transcript° (activateurs, répresseurs)
        
        modifier ADN : ex méthylat°, enz de restrict°
    - - modif ADN bactérien sur séq GATC
      - catalysée par méthyl-transférase DAM (Desoxy Adenosine Methylase)
      - méthyl prélevé sur S-Adenosyl-méthionine
      - régulat° express° des gènes et réparat° ADN
      - méthylat° des cytosines
        
        catalysée par des méthyl transférases
        
        méthyl prélevé sur S-Adenosyl-méthionine
        
        procaryotes
        
        modif ADN bactérien sur séq CCAGG et CCTGG
        
        catalysée par DCM (desoxy cytidine methylase)
        
        régulat° express° des gènes et réparat° ADN
        
        eucaryotes
        
        modif ADN sur séq répétées (îlots) CpG
        
        catalysée par DNMT
        
        marque épigén réversible
        
        régulat° express° gènes
    - - ADN pas nu ms associé à divers facteurs
      - compact° par act° divers prot associées au nucléoïde (NAP)
      - format° boucles et sous-dom
  - - - 1er degré de compact° par histones
      - intéract° non spé
      - 146 pb par tour
      - nucléosome = coeur d'histone + 200 pb
    - - coeur d'histones formés par 2 copies H2A, H2B, H3 et H4
      - histones H3 et H4 = extrêmemt conservées entre esp
      - histone H1 intérait avc ADN linker
    - - AT
        
        sillion mineur : comprimable
      - CG
        
        sillon mineur : rigide
    - - AA basiques (R et K) contactent
        
        ADN internucléosomal
        
        AA acides (D et E) des coeurs
      - intéract° renforcent compact° (répress° express° ) ADN
      - modulat° pr modif AA basiques
    - - acétylat° lys et arg par histone acétyl-transférase (HAT)
        
        réact° inverse catalysée par Histones DéAcétylases (HDAC)
      - méthylat° lys et arg par Histone Méthyl-Transférases (HMT)
        
        réact° inverse catalysée par histones DéMéthylases (HDM)
      - phosphorylat° Ser, Thr et Tyr par kinases
        
        réact° inverse catalysé par phosphatases
    - - queues histones = cibles nbrx enz de modif
        
        méthylat°,, acétylat°, phosphorylat°, sumoylat°, ADP-ribosylat°, ubiquitinylat°
    - - hétérogénéité et variabilité modif histones font penser à un code
        
        profil de modif variable d'1 histone à autre
        
        act° concertée voire antagoniste d'1 multitude d'enz
        
        présence d'1 modif influence présence autres modif
        
        code est une marque épigén
      - act° conjointe avc méthylat° ADN et autres mécanismes de régulat°
- - - - lors transcript° en ARN
  - - - U à la place T
    - - polymérisat° de ribonucléosides triphosphates
        
        synth de 5' vers 3' par lecture d'1 matrice
        
        réact° catalysée par ARN polymérase ADN dépendante
        
        30 à 200 incorporat° par sec suivant enz
        
        démarrage amorce-indépendant sur promoteur de transcript°
    - - principe de l'hydrolyse alcaline
        
        instabilité nécessaire à une express° génique transitoire
    - - RNase A = endonucléase coupant ap les pyrimidines non appariées
    - - paires GU/UG communes ds hélices ARN
      - implicat° ribose et phosphate ds liaison H
    - - mol simple brin
      - si structurée, forme une hélice droite maintenue par empilemts de bases
      - forme non structurée peu fréquente
      - tend à former struct 2ndr
        
        single strands
        
        bulge
        
        internal loup
        
        hairpin (tige-boucle)
    - - interférence entre le 2'OH et le phosphate
      - sucres C-3' endo
      - hélices ARN/ADN et ARN/ADN de forme A
    - - maturat° extrémité 5' ARN de transfert (ARNt)
        
        primary transcript
        
        où RNase D et P cut
        
        de primary transcript at intermediate
        
        base modificat°
        
        5' cleavage
        
        3' cleavage
        
        CCA addition
        
        intermediate at mature tRNA : splicing
    - - struct confère fonct° (reconnaissance et clivage)
    - - intéract° avc facteurs protéiques
      - apport AA
      - lecture ARNm
      - struct et fonct° assistée par bases modifiées
    - - activat° of AA : tARN aminoacylated
      - initiat°
        
        mRNA and aminoacylated tRNA bind to sall ribosomal units
        
        large subunit then binds
      - Elongat°
        
        successives cycles of aminoacyl-tRNA binding and until the ribosome reaches a stop codon
      - Termination
        
        translation stops when a stop codon is encountered
        
        mRNA and protein dissociate and ribosomial subunits are recycled
      - Protein felding and posttranslationnal processing
    - - struct très complexe
    - - capacité codante et catalytique ARN
      - rôle central ARN ds vie Cr (express° et régulat° des gènes, co-facteur métabolique)
- - - - séquençage acides nucléiques
        
        lecture ADN par séquençage
        
        nbrx technologies disponibles variant en débit
        
        plupart repose sur principe extens° amorce
        
        dénaturat° (T° élevée)
        
        Hybridat° (T° baissée)
        
        polymérisat°
        
        plus amorce ADN SB marquée au 32 P et complémentaire d'1 brin
        
        extens° amorce avc ddATP
        
        ADN polymérase
        
        mélange ADN SB marqué en 5' finissant ts par 1 ddA
        
        extens° amorce avc 4 ddNTP
        
        ddATP
        
        ddTTP
        
        ddCTP
        
        ddGTP
        
        automatisat° méthode
        
        ddNTPs marqués par fluorophore
        
        1 couleur par ddNTP
        
        réalisat° 4 réact° en 1 tube
        
        96 à 284 réact° analysées en //
        
        analyses très ht débit
        
        analyse de pls 10aines-100aines de millions de séq en //
        
        ouvre la voie vers analyse génomique et transcriptomiques
        
        séparat° par électrophorèse
        
        lecture sur autoradiogramme (obtenu par contact d'une plaque photographique à 1 obj imprégné de sub radioactives)
        
        méthode de Sanger
        
        didésoxyribonucléotide = terminateur
        
        terminaison extens°
      - transplantat° séq (clonage, bio de synth
        
        express° de gènes exogènes
        
        technologie ADN recombinant
        
        associat° ADN origines différentes
        
        obtent° chimère synthétique
        
        intro construct° ds organisme (génétiquemt modifié)
        
        product° d'1 prot
        
        étude de syst bio
        
        doter un organisme de nv propriétés
        
        fondemt bio de synth
        
        rôle central enz de restrict°
        
        origine de réplicat°
        
        promoteur
        
        marqueur de sélect°
        
        exemple de clonage de gène
      - édit° des génomes
      - dév acides nucléiques artificiels
      - nanotechnologies
      - amplificat° acides nucléiques
        
        amplificat° spé
        
        spécificité par utilisat° amorces complémentaires à ADN cible
        
        utilise des amorces de synth
        
        dirigée par complémentarité des bases
        
        amplicat° par ADN polymérase
        
        approches isothermes (1 T°)
        
        approches par cycles de T° (thermocyclage)
        
        réact° de polymérast° en chaîne
        
        hybridat° à 55°
        
        dénaturat° à 95°
        
        extens° à 72°
        
        composit° milieu PCR
        
        adn poly ADN dépendante thermostable
        
        amorces spé de synth
        
        tampon et additifs
        
        dATP, dCTP, dGTP, dTTP
        
        propriétés PCR
        
        produit apparaît qu'au 3ème
        
        amplicat° exponentielle (2^n)
        
        1 mol amplifiée 1 mio fois en 20 cycles PCR
    - - large palette de modif
        
        (dé)phosphorylat°
        
        adénylat°
        
        méthylat°
        
        ligat°
        
        digest°
      - enz de restrict°
        
        endonucléases spé
        
        nommées d'ap leur origine
        
        syst bactérien de déf antivirale impliquant les enz de modif et de restrict°
        
        types
        
        type 1
        
        complexe pls ss-unités assurant à la fois modificat° et restrict° (nécessite ATP et Mg2+)
        
        reconnaissance d'1 séq spé
        
        coupure à dist hors site du reconnaissance
        
        type II
        
        enz dimériques assurant uniqemt restrict° (nécessite mG2+)
        
        reconnaissance d'1 séq spé palindromique continue ou discontinue
        
        coupure ds site de reconnaissance
        
        type IIS
        
        enz monomériques assurant uniqemt résitrict° (nécessite Mg2+)
        
        reconnaissance séq spé non palindromique
        
        coupure hors site reconnaissance
      - nature extrémités
        
        extrémités franches
        
        extrémités cohésives
        
        5' sortantes
        
        ou 3' sortantes
      - syst de défense CRISPR-Cas
        
        Cas9 programmed by crRNA : trascrRNA duplex
        
        outil CISPR-Cas9
        
        reconnaissance et clivage par 1 prot unique (Cas9) chez Streptococcus pygogenes
        
        reconnaissance dirigée par 1 ARN guide unique (single guide RNA; sg RNA)
  - - - aptamères = ptt oligonucléotides SB reconnaissant spécifiquemt 1 mol cible (de l'ion à prot)
    - - systematic evolut° of ligands by exponential enrichmt (SELEX)
        
        transcript°
        
        enriched library
        
        starting librart
        
        bead conjugated with target
        
        partit°
        
        élut°
        
        gal : aptamère ARN + fluorogen -> complexe fluorescent
      - analyses fluorescences individuelles (criblage fonctionnel)
    - - outils de détect° (fluorescence, reconnaissance spé ptt mol)
      - affinités comparables aux Ac (nM)
      - peu immunogènes
      - product° en masse très reproductible
      - mol facilemt modifiable (utilisat° de nucléotides non naturels)
      - excellente alternative aux Ac en thérapie et biotechnologies
    - - utilisat° propriétés de repliemt et assemblage acides nucléiques pr créat° architecture tridimensionnelle contrôlées