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Pretractament de mostres biologiques - Coggle Diagram
Pretractament de mostres biologiques
Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra. En muchas ocasiones se requiere un pretratamiento que permita obtener suspensiones celulares sobre las que se realizará la extracción y purificación de estos
Tejidos animales o vegetales frescos
Homogeneización mecánica manual con mortero
Se coloca los tejidos en un mortero con nitrógeno-congelación rápida sin cristales
Con la mano de mortero pulverizamos fragmentos congelados-polvo fino
El polvo se transfiere a un tubo limpio
Homogeneización química
Se añade a la muestra mezcla de incubación-proteasas y detergentes-digestión tejido
Incubación-37-56grados durante 12-24 horas
Se retira la muestra y se sigue con la extracción
Homogeneización mecánica automatizada
El tejido se corta en fragmentos y se homogeneiza por la acción mecánica, adición de agentes abrasivos y agitación, por esferas de vidrio que colisionan contra la muestra-movimiento de oscilación o sonicacióm
El tejido se transfiere a un tubo limpio
Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina
Se transfieren 5-10mg de cortes a un eppendorf
Se incuba con xilol o otro desparafinante,etanolesde concentración decreciente y agua destilada
Con un micrótomo se obtienen cortes finos de tejido
El tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización quimica simikar a los tejidos frescos
Cultivos celulares
Cultivos en suspensión
Recolectar en un tubo
Eliminar medio de cultivo-centrifugación
Lavar las células con tampón antes de realizar la extracción y purificación de ARN y ADN
Cultivos en monocapa
Usar el propio frasco
Lavar la monocapa con tammpón
Iniciar in situ el proceso de extracción
Retirar del frasco el medio de cultivo
Pasar la monocapa a un tubo
Despegar la monocapa de la pared del frasco
Mecánica: raspador
Medios enzimáticos
Recolectar celulas en tubo
Lavado antes de realizar extracción
Otras muestras
Celulas mucosa oral
Se centrifuga y se elimina el sobrenadante
Esputo
Fluidificación con agente mucolítico del tipo de la N-acetil-L-cisteína en una disolución de citrato sódico.
Cultivos de bacterias y levaduras
Cultivos en medio liquido
Centrifugación-eliminar medio cultivo sobrenadante
<Sedimento-resuspende en el tampon de suspensión
Colonias en medio sólido
Se recoge una colonia de la placa con un asa de siembra estéril
Resuspende la colonia en el tampón de suspensión
Sangre
Es una de las muestras mas habituales para el estudio de acidos nucleicos
Consideraciones sobre la obtención y conservación
Sangre anticoagulada con EDTA , heparina y citrato sódico
El pretratamiento más habitual consiste en
Centrifugado de la muestra: Se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento (pellet) y un sobrenadante.
Eliminación de sobrenadante: Se elimina la fracción líquida con una pipeta pasteur. Eliminamos componentes del plasma y la hemoglobina
Conservación del sedimento
Lisis de los hematíes: Romper hematíes con solución tampón de lisis
La extracción realizarla preferentemente en 24 horas a la obtención si no refrigerar a 4 grados
Obtención de células mononucleadas de sangre periférica
Se centrifuga durante 20-30 min a 400-800 xg
La polisucrosa causa agregación de los hematies facilitando sedimentación
Los granulocitos sedimentan al fondo
Las células mononucleadas permanecen en la interfase entre este y el plasma
La capa de mononucleados se aspira, se transfiere a un tubo limpio y se lava con tampón para eliminar restos
Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre
A partir de las celulas lavadas podemos extraer A.N