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Téc. Biomol - Coggle Diagram
Téc. Biomol
PCR trad. K. Mullis (1988)
Extração
Quantificação
Espectrofotometria
Fluorometria
Integridade
Pureza
Componentes
Taq polimerase
Primers específicos
Desoxirribonucleotídeos trifosfato
Tampão (íon Mg)
Ciclagem
Hibridiza
Gel eletroforese
Gel eletroforese
Campo elétrico
Separação peso
Brometo etídeo/Sybr Green
Extende
Desnatura
Limitações
Baixa precisão
Baixa sensibilidade
Baixa resolução
Não automatizado
Pós processamento do produto
Descriminação do tamanho do fragmento
qPCR Higuchi et al. (1992)
Extração
Quantificação
Espectrofotometria
Fluorometria
Integridade
Pureza
Quantificação
Relativa
Gene controle
Amostra controle/amostra teste
Curva de calibração para definir eficiência
Não requer curva de calibração
Análise dos dados (Ct/cq)
Normalização pelo input
Absoluta
Curva de calibração
Valor Ct/Cq da curva/padrões de amostras de conc. conhecida
Avaliação da eficiência de amplificação
Verificação do slope
Sistemas de detecção
Sistema óptico excitação e detecção da fluorescência
Sonda hidrólise TaqMan
Fluoróforos repórter 5´ e quencher 3´
FAM/TAMRA limitações com SNP
FAM/MGB "enchancer" de Tm
Maior custo
Maior especificidade
Corante intercalante Sybr Green
Não requer o uso de sonda
Pode gerar falsos positivos, caso não valide
Menor especificidade
Set up mais simples
Menor custo
Software de aquisição de dados e análise
PCR tempo real
Monitoramento ao vivo da amplificação DNA
Utilizado quantificação do cDNA
Quantificação expressão gênica
Fase exponencial
Níveis mensuráveis (Ct/Cq)
PCR tradicional
Outras aplicações
Id. Microrganismos
Diagnóstico
Genotipagem
Forense
Fluxo para outras técnicas
Clonagem
qPCR
Sequenciamento