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Marqueurs - Coggle Diagram
Marqueurs
A. Comprendre et réaliser un immunomarquage observable en microscopie photonique
choix et caractéristique matériel biologique
C en culture ou fragmt tissu ? = étape fixat°
C
animales
accès direct à memb
C adhérentes à leur support
Etape adhés° à une lamelle
végétales
présence paroi = étape digest°
C non adhérentes à support
fongiques
2 protocole fixat° chim/lavage/préservat°
fixateur préserver antigénicité (capacité d"1 struct chim (Ag) à se lier sépmt à crtns élémts syst imm adap)
aldéhydes (formé en enlevant 1 H d'un alcool)
prot intérêt directemt accessible ?
perméabilisat° memb plasm avc détergent
prot intérêt solubles ou membranaires ?
perméabilisation ménagée de memb plasm
prot intérêt cytoplasmiques ou nucléaires ?
concentration détergent/durée perméabilisat°
chois des Ac et protocole immuno
matériel mort fixé chimiquemt
but: localiser Ag Cr ou subCr par Ac
révéler Ac par ptte mol chim fluorescentes fixée directemt ou indirectemt sur cet Ac
2 méthodes immunomarquage
marquage direct (jms utilisé) : Ac 1re fluorescent fixé sur Ag Cr (protà
marquage indirect : Ac 2ndr fluorescent (origine différente d'Ac 1re, marqué par Alexa) fixé sur Ac 1re étant fixé sur Ag
struct Ac
pont disulfure entre 2 chaînes lourdes
IgG = immunoglobulines
paratope = site de reconnaissance spécifique d'1 ptte séq d'AA
épitope = port° d'1 mol Ag reconnue par paratope
rég° constante et variable
produire Ac 1ère = immunoglobulines
purifier Ag
injecter ds syst vivant le reconnaissant comme "non soi"
induit synth Ac spécifiquemt dirigés vs cet Ag = immunoglobulines (Ig)
ex : oeuf poule (IgM), lapin et souris (IgG)
purifier Ac synth : sur colonne séparant prot selon PM ou par affinité
ex : Ag = alpha-tubuline -> Ac 1er : IgG de souris anti-alpha-tubuline
pls séq différentes d'1 Ag correspondant à pls épitopes
1 Ac reconnaît un épitope
obtent° Ac polyclonaux : pls Ac différents synthétisés par Ag
fus° de C avc 1 souche tumorale = hybridome
chq C produit 1 Ac spé d'1 seul épitope
= utilisat° Ac monoclonaux
Montage et observat°
montage ds milieu où agent anti-fading (revêtemt anti-UV pr éviter décolorat°)
observat° au microscope avc blocs filtres adéquats
Dév nv approches : chromobodies
nanobodies ou nanoAc
sous esb Ac chez minorité esp (camélidés, requin ,nourrice)
variants existent pas chez H
possèdent que chaîne H (heavy) pr liaison à Ag : camel heavy-chain antibody
Ac simple domaine ("single-domain antibody" ou nanobody") correspond au dom variable d'1 chaîne H (VH)
12 à 15 kDA (110 AA) = 1/10 taille Ac communs
possible exprime nanobodies en fus° avc GFP (chromobody = GFP + bout Y ac)
m^affinité + sélectivité que Ac conventionnels
très bonne solubilité + stabilité
codés par 1 seul gène
product° facile en syst hétérologue (E. coli)
co-express° ap transfect°
B. Compléter/cumuler immuno-marquage avc usage sonde fluorescente
sondes = marquage spé de struct Cr
ex : DAPI (bleu) : marqueur chromosomique (noy)
vraimt fluorescent que lorsque lié à ADN
avc rajout détergent
ex : iodure de propidium (rg)
marque paroi C végétales vivantes car passe pas barrière membranaire
marque noy C mortes dt memb devenue perméable
ex : Phalloïde-fluorescente (vert)
palloïdine-FITC : FITC (vert) = fluorochrome
phalloïdine-rhodamine (rg)
marquer filamt actine
C. prot fluorescentes par génie gén
cloner séq gène intérêt ds vecteur express° (plasmide) sous contrôle promoteur en fus° avc séq nucléotidique de GFP et avc terminateur
ordre
promoteur express°
viral, du gène intérêt (adapté aux C/ organismes transfectés)
séq codante prot intérêt avc sites de restrict° spé à chq extrémité
séq codante de GFP
terminateur
tansfect° transitoire ou stable = insert° de contruct° (plasmide) ds génome
ex dble transformat°
histone RFP marque chromatine (rg)
prot associée au cytosquelette (TPX2)-GFP colore fuseau mitotique (vert)
application confocal : Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
suivre réapparat° fluorescence ds vol où fluorophores été détruits par photoblanchimt (perte fluorescence mol)
ex; restaurat° fluorescence cytosquelette microtubulaire