Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
3. Purificació d'àcids nucleics - Coggle Diagram
3. Purificació d'àcids nucleics
Purificació amb dissolvents orgànics
Diferent solubilitat dels compostos que integren la lisi cel·lular en dissolvents orgànics
1-Eliminació de composts solubles en dissolvents orgànics
2-Precipitat d'ADN
3-Rentat d'ADN
4-Resuspensió amb ADN
Rehidratació = procés lent:
Incubació inicial 55-65 ºC
Segona incubació a temperatura ambient
Agitació suau
Ultima incubació a 4 ºC i guardar 24h
Precipitació en sals
Precipitació de proteïnes en presencia d'altres concentracions salines
2- Precipitació d'ADN
3-Rentat i resuspensió de l'ADN
1- Precipitació de proteïnes
Cromatografia d'intercanvi iònic
Unió grup funcional és reversible i el tipus varia depèn la concentració salina i el pH del medi
Carrega neta negativa: intercanviadors catiònics. S'uniran els ions positius (cations)
Carrega neta positiva: intercanvia d'aniònics. S'uniran irreversiblement a ions negatius (anions)
A la matrius s'hi uneix covalentment un intercanviador aniònic. Àcids nucleics = forta carrega negativa (grups fosfat)
Columna de cromatografia
Neteja de columna
Elució de l'ADN
Permet purificar de manera individualitzar diferents tipus d'àcids nucleics, gràcies a la carrega neta
La mida dels porus de la matriu utilitzada influeix directament amb la capacitat dunio:
En porus petits no hi ha espai suficient
En porus grans poden unir-se al interior i augmenta la quantitat del ADN
Cromatografia d'adsorció
Capacitat d'absorció que tenen els nucleics al vidre i al silici en presencia de sals caotròpiques
El silici té una estructura molecular tetraèdrica capaç de formar ponts d'hidrogent
El mecanismes de purificació es basa en l’absorció i desabsorció dels àcids
nucleics en presencia de sals atròpiques
Les proteïnes i altres metabòlits no s’uneixen el vidre i per tant són
eliminats amb els rentats.
Posteriorment els àcids s'elueixen mitjançant tampons amb poques sals o simplement amb aigua, ja que els permet recuperar la capa hidratant.
Els àcids nucleics estàn recoberts per una capa hidratan de molècules d'aigua unides al grup fosfat mitjançant ponts d'hidrogent
(les caes hidratans de les dos impedeixen l'interacció entre elles)
Purificació mitjançant esferes magnètiques
ADN unit a microesferes magnètiques retingut mitjançant un imant
Per adsorció: units a silici o grups funcionals que recobreixen les microesferes
Per afinitat: unit a polímers sintètics o naturals que recobreixen les microesferes
Microesferes constituïdes per nanopartícules de magnetita encapçalades en la matriu interna
La ultrafiltració
Retenció segons la mida de les molècules de ADN
Carregar la mescla de la PCR
Rentat del filtre
Resuspensió de l'ADN
Purificació de productes amb mida superior a 150 pb (sals, nucleòtids...)
Mostra carregada sobre membrana d'ultrafiltració. Mitjançant buit i centrifugació s'eliminen tots els contaminants
Recuperació dels àcids nucleics afegint aigua o un tampó adequat
Purificació de plasmidi
S'utilitzen com a vectors per clonar seqüencies gèniques
Centrifugació en gradient de densitat
Diferencia de densitat dels dos tipus de molècules
Lisi Alcalina
Diferencia en el procés de desnaturalització i renaturalització
Lisi Alcalina: afegim bacteris en suspensió una solució pH=11
Neutralització rapida:
Solució concentrada d'acetat de potassi pH=4,8
Renaturalització dels components de la mescla
Precipitació de les proteïnes juntament amb la sal potàssica del SDS
Purifiació del ADN plasmídic: el sobrenadant es transfareix a un tub net tractat amb ARNases per elimina el ARN
Purificació de ARN
.
ARN sensible davant l'acció de les ARNases, produeix degradació
ARNases enzims molt resistents i presents en la majoria de superficies i matèries
El calor no les elimina, ja que quan es desnaturalitzen al restablir la temperatura activen de nou la seva activitat
No son necessaris els cations de magnesi pel seu funciones (EDTA no els inactiva)
Extracte cel·lular complex:
Proteïnes
Sals minerals
Components cel·lulars solubles
Els reactius d'extracció de lisi
Separar els àcids nucleics de la resta de components