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DIASNOSTICA DI LABORATORIO 2 (COLORAZIONE GRAM) - Coggle Diagram
DIASNOSTICA DI LABORATORIO 2 (COLORAZIONE GRAM)
COLORAZIONE DI GRAM
ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO
FISSARE IL PREPARATO PASSANDO IL VETRINO 4-5 VOLTE DIRETTAMENTE SULLA FIAMMA.
PORRE UN’ANSATA DI COLONIA (O SOSPENSIONE) BATTERICA AL CENTRO DI UN VETRINO PULITO,
SI AGGIUNGE UNA GOCCIA DI H2O.
STENDERE IL PREPARATO E COPRIRE CIRCA LA METÀ DELLA SUPERFICIE DEL VETRINO.
LASCIARE ASCIUGARE IL PREPARATO ALL’ARIA O TRAMITE CALORE (BUNSEN).
PRINCIPIO
COLORAZIONE POLICROMATICA CHE PERMETTE DI DIFFERENZIARE TRA MICRORGANISMI ED IN PARTICOLARE DI SUDDIVIDERE I BATTERI IN 2 GRUPPI: GRAM+ E GRAM- GRAZIE ALLA DIVERSITÀ DELLE LORO PARETI
RICHIEDE L’USO DI 4 SOLUZIONI IN SEQUENZA:
SOLUZIONE 2: UN MORDENTE (IODIO) – SOLUZIONE DI UGOL
ACCRESCE L’AFFINITÀ TRA CELLULA E COLORANTE FISSANDOLO SULLA CELLULA E RENDENDO + DIFFICILE LA DECOLORAZIONE.
SOLUZIONE 3: UN AGENTE DECOLORANTE – ALCOOL 95%:
ALCUNE CELLULE SI DECOLORANO + FACILMENTE DI ALTRE PERMETTENDO LA DIFFERENZIAZIONE TRA BATTERI.
SOLUZIONE 1: UN COLORANTE BASICO – CRISTAL VIOLETTO
SOLUZIONE 4: UN COLORANTE DI CONTRASTO – SAFRANINA:
È UN COLORANTE BASICO DI COLORE DIVERSO DAL CRISTAL-VIOLETTO.
I MICRORGANISMI CHE RISULTANO RESISTENTI ALLA DECOLORAZIONE TRATTENGONO IL COLORANTE BASICO INIZIALE (BATTERI GRAM- POSITIVI),
GLI ALTRI (BATTERI GRAM-NEGATIVI) ASSUMONO IL COLORANTE DI CONTRASTO.
INTRODOTTA DA C. GRAM NEL 1884 UTILIZZA IN SEQUENZA 2 DIVERSI COLORANTI: IL CRISTALVIOLETTO E LA SAFRANINA.
NEI BATTERI GRAM+
IL DECOLORANTE CONDENSA X DISIDRATAZIONE LA STRUTTURA PEPTIDOGLICANICA.
IN QUESTO MODO, IL COMPLESSO CV-I VIENE “CATTURATO” DALLA PARETE CELLULARE
IL CRISTALVIOLETTO E LO IODIO SI COMBINANO A FORMARE UN COMPLESSO (CV-I) DI GROSSE DIMENSIONI
CHE PRECIPITA ALL’INTERNO DELLA CELLULA.
NEI BATTERI GRAM-
IL DECOLORANTE, AGENDO COME SOLVENTE LIPIDICO, DISSOLVE LA MEMBRANA ESTERNA DELLA PARETE CELLULARE
COSÌ PERMETTENDO IL RILASCIO DEL COMPLESSO CV-I E, QUINDI, LA DECOLORAZIONE DELLA CELLULA BATTERICA.
COLTURE CONTINUE
E’ POSSIBILE PROLUNGARE ARTIFICIALMENTE LA FASE DI CRESCITA ESPONENZIALE DI UNA COLTURA PER IL TEMPO CHE SI DESIDERA,
UTILIZZANDO PARTICOLARI SISTEMI (CHEMOSTATO, TURBIDOSTATO) IN CUI, CONTEMPORANEAMENTE,
DA UNA PARTE SI HA SOTTRAZIONE DI TERRENO INVECCHIATO CON SOSPENSIONE CELLULARE
E DALL’ALTRA SI HA AGGIUNTA DI UGUALE QUANTITÀ DI TERRENO FRESCO.
IN TAL MANIERA SI MANTIENE INDEFINITIVAMENTE LA COLTURA IN CONDIZIONI OTTIMALI,
PER CUI SI HA LA MOLTIPLICAZIONE DI TUTTI I BATTERI PRESENTI.
LA DISTINZIONE TRA GIOVANE E VECCHIA NON RIGUARDA LA CELLULA BATTERICA
MA È DOVUTA ALLE CONDIZIONI DEL MEZZO DI COLTURA E ALLA DISPONIBILITÀ DI NUTRIENTI
NORMALMENTE SI DICE CHE UNA COLTURA È GIOVANE,
QUANDO È IN FASE LOGARITMICA DI SVILUPPO E VECCHIA QUANDO SI TROVA IN FASE STAZIONARIA.
CHEMOSTATO:
IL TERRENO CONTIENE UN FATTORE LIMITANTE;
IL TASSO DI CRESCITA DIPENDE DALLA VELOCITÀ DI IMMISSIONE DI TERRENO FRESCO;
IL TASSO DI CRESCITA VIENE MANTENUTO COSTANTE
TURBIDOSTATO:
LA DILUIZIONE DEL TERRENO VARIA A SECONDA DELLA VELOCITÀ DI CRESCITA DELLA COLTURA;
LA TORBIDITÀ VIENE MANTENUTA COSTANTE.
NON CI SONO FATTORI LIMITANTI NEL TERRENO;
MISURAZIONE DELLA TORBIDITÀ MEDIANTE SPETTROFOTOMETRO
È LA MISURA RELATIVA
NON È ADATTA CON SOSPENSIONI CON MENO DI 10 ALLA 7° CELLULE/ML
NON È ADATTA CON CELLULE CHE CRESCONO IN AMMASSI
SI DETERMINA L’ASSORBANZA
DIAGNOSI DIRETTA
PRINCIPI DI IDENTIFICAZIONE:
MICROSCOPICHE (MORFOLOGIA, ORGANIZZAZIONE):
COLORAZIONE DI GRAM, ZIEHL-NEELSEN
BIOCHIMICHE:
OSSIDASI, CATALASI ECC.
ID PRESUNTIVA (PRELIMINARE) SI BASA SULLE CARATTERISTICHE PRINCIPALI DEL MICRORGANISMO:
MACROSCOPICHE (COLTURALI): TIPO (ASPETTO) COLONIALE; EMOLISI, MOTILITÀ (SCIAMAGGIO), ETC.; CRESCITA SU TERRENI SELETTIVI/DIFFERENZIALI
L'ATTENDIBILITÀ DELLE PROVE PRIMARIE SI BASA PRINCIPALMENTE SULLA STABILITÀ DELLE CARATTERISTICHE FENOTIPICHE.