BATTERIOFAGI
curva crescita batteriofagi
strategia anti-batteriofago
tesi su approcci tecnologici per la rimozione del biofilm nell'industria alimentare
i batteriofagi possono essere usati per contrastare la crescita di microrganismi patogeni o alterativo
infezioni di un fago lisogeno (o temperato)
sistema CRISP-Cas
sistema CRIP-Cas
click to edit
conta di particelle fagiche: il metodo delle placche
click to edit
la particella virale
i batteriofagi
come tutti i virus,
tipi batteriofagi
i batteriofagi
sono considerati
le entità biologiche
più abbondanti
in natura,
superando numericamente
i batteri
di circa 10 volte
sono parassiti intracellulari
obbligati;
non possiedono
le informazioni
genetiche
che permettono
la produzione
di energia metabolica
e la sintesi proteica
matura
si chiama virione
ed è costituita
da una molecola
di acido nucleico
(DNA a singola
o doppia elica,
RNA)
rivestita da
un involucro proteico
chiamato capside
si classificano
in base al contenuto
di acidi nucleici
e alla struttura
del virione
ad RNA
i più conosciuti e diffusi:
a DNA a singolo filamento
MS2
Phi 6
a singolo filamento
a doppio filamento
Phi X174
e fd, M13
(più lungo)
(esagonale)
(esagonale con membrana esterna)
(esagonale e su ogni punta una membrana sferica)
DNA a doppio filamento
lambda
T3,T7
T2,T4
infezioni di un fago a ciclo litico
alcuni fagi
in base
a questo punto,
click to edit
il batteriofago
alcuni fagi lisogeni,
riconosce
specifici recettori
situati sulla superficie
del batterio
e inietta
il suo acido nucleico,
mentre l'involucro proteico
rimane all'esterno
il genoma fagico
può seguire
due vie
a litica
o lisogeno
possiedono solo
il ciclo litico,
ma latri alternano
ciclo litico
e ciclo lisogeno
mutando,
perdono la capacità
di produrre
anche un ciclo litico
e rimangono integrati
nel genoma batterico,
contribuendo
alla sua evoluzione
ciclo litico:
ciclo lisogeno:
il fago
utilizza l'apparato
di replicazione
dell'ospite
per produrre
nuove particelle
fagiche,
fino al momento
in cui la cellula
si disgregherà per lisi,
liberando
centinaia di particelle
fagiche
un batterio
lo stato di profago
in questo stato integrato,
e la disattivazione
il genoma fagico
si integra
nel cromosoma batterico
il fago
viene chiamato
profago,
e ogni qual volta
il cromosoma batterico
si replica,
il genoma integrato
si replica anch'esso
che contiene
un profago
è detto "lisogeno"
e risulta immune
dall'attacco
di fagi
della stessa specie
è mantenuto
da una specifica
proteina
prodotta dal fago stesso
di questo repressore
induce
il ciclo litico
alla classe del virus
ho un genoma nel virione
2) virus a RNA
3) RNA <-->DNA virus
1) virus a DNA
2) RNA ss, RNA ds
3) SS RNA (retrovirus), ds DNA (espanavirus)
1) DNA ss, DNA ds
2) penetrazione (iniezione)
3) sintesi
1) attacco (adsorbimento)
ho il virione con il DNA
che si attacca
alla cellula ospite
il rivestimento proteico
e il DNA virale entra
rimane all'esterno
dell'acido nucleico
e delle proteine
4) assemblaggio
e impacchettamento
(si creano virioni con il DNA)
5) rilascio (lisi)
si rompe
la membrana della cellula
ed escono
i nuovi virioni con DNA,
pronti ad infettare
nuove cellule
la qualificazione
e si aggiungono
uso il metodo placche, s(simile alla semina su piastra di popolazione microbica)
2) inoculo
1) porre la miscela
ho uno stato in cui,
sulla superficie
di una piastra
di agar nutritivo
in una fiala
(ho una miscela
contenente
lo strato superiore
di agar sciolto
e poi ho una
piastra di agar nutritivo
ho "sandwich"
formato dallo
strato superiore
di agar
e dall'agar nutritivo
sulla piastra avrò
lo strato di
cellule ospiti
e le placche fagiche
del titolo virale
è eseguita
tramite la
conta delle placche
i virioni
a una piccola quantità
di agar fluida,
contenente
una coltura
di batteri sensibili,
il quale è poi
uniformemente distribuito
sulla superficie
di un terreno solido
contente agar
la miscela
viene lasciata solidificare
e si ha un periodo
di incubazione
dei batteri
durante il quale
questi crescono
e formano
uno strato torbido
visibile
ad ochio nudo
dovunque abbia inizio
un'infezione virale
produttiva,
avverrà la lisi
delle cellule infettate,
e si potrà osservare
una zona
più chiara
ovvero la piccola
dal numero di placche
prodotte
si può stimare
il titolo virale,
espresso come CFU
(unità formanti colonia)
e conteggio virale relativo
(unità formanti placche)
appena aggiungo il virus, (asse y)
in funzione tempo (asse x)
poi ho assemblaggio e rilascio
ho un periodo di latenza,
(ho stesso
conteggio virale,
(conteggio virale aumenta)
poi fase latenza)
iniezione
ho 2 strade,
ho l'attacco (adesione)
(del virus temperato con DNA
sulla cellula (ospite))
(rivestimento proteico
rimane all'esterno)
(nella cellula ho i 2 DNA)
via litica:
via lisogenica:
il DNA virale
si replica
ho la sintesi
delle proteine
del rivestimento,
e sono assemblate
le particelle virali
ho la lisi,
(rottura parete cellulare
e uscita del virus temperato)
il DNA virale
è integrato
nel DNA dell'ospite
ho la cellula lisogenizzata
(il DNA virale
integrato in quello
dell'ospite
e detto profago)
ho la divisione cellulare
(ottengo 2 cellule figlie)
in determinate condizioni
posso avere poi
il ciclo litico
una induzione
poi ho la sintesi
delle proteine
del rivestimento,
e sono assemblate
le particelle virali
ho la lisi,
(rottura parete cellulare
e uscita del virus temperato)
principali strategie batteriche
per evitare infezione fagica,
grazie
allo sviluppo di
metodi sempre più
specifici
per caratterizzare
e analizzare
i fagi,
è possibile sviluppare
strategie per prevenire
o contrastare
l'infezione fagica
nei processi industriali
in processi industriali,
utilizzo di starter
trattamenti
chimici
e fisici
per decontaminare
l'impianto industriale
rotazione
delle specie batteriche
insensibili
ai batteriofagi
(BIM, bacteriophages insentive mutant)
di resistenza ai fagi:
degradazione
matrice extracellulare
mutuazione
dei recettori riconosciuti
dai fagi
il fago
per iniziare l'infezione
deve legarsi
in modo specifico
ad un recettore
presente sulla superficie
del batterio
(es. propina,
proteine del pilo
o del flagello)
un recettore maturo
non è riconosciuto
dal fago
qunidi il batterio
con questa mutazione
diventa resistente
al fago,
batterica
(la capsula e/o
il biofilm
creano
una barriera
tra fago
e recettore)
dell'acido nucleico virale
prima che possa
avvenire
la replicazione
(es. il sistema CRISP-Cas)
parte integrante
e singole mutazioni
tale batterio
in tale cellula,
è naturalmente
l'acquisizione
cluster di
questo inserisce
clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISP)
nella popolazione fagica
brevi sequenze
di DNA batterico
ripetute,
separate
da sequenze spaziatrici
di origine eterologa,
che mediano
una forma di immunità
acquisita
rispetto a specifici fagi
presente
in molte specie batteriche
e può essere
ingegnerizzato
per ampliare
lo spetro
di resistenza
ai fagi in
culture starter
infettante
può essere
naturalmente presente
un fago mutante,
leggermente difettoso
(attenuato)
il suo genoma
in una cellula
ma non produce
un ciclo litico
efficacie
il DNA fagico
viene degradato
e parti del materiale
genetico
fagico (proto-spacers)
sono incorporate
nella regione CRISPR
tra una sequenza
ripetuta
e l'altra
di tali sequenza
rende il batterio
resistente
verso i fagi
di quella popolazione
produrrà
una progenie resistente
nel genoma del fago
sono sufficienti
ad evolvere
una contro-resistenza
di questo meccanismo
di difesa anti-fago
è l'azione di proteine
CRISPR-associate (CAS)
e i geni codificanti
per le proteine Cas
si trovano solitamene
adiacenti
alla regione CRISPR
nella fase iniziale
dell'invasione virale,
i complessi
di proteine Cas
integrano
i proton-spacers
nella sequenza CRISP
se un fago
attivo
e virulento
infetta un batterio
che contiene
nel suo genoma
una regione di DNA
già presente
in CRISPR,
le proteine CAS
la riconoscono
e degradano
l'intero genoma virale,
impedendo così l'infezione
in una regione CRISPR
è possibile modificare
possono essere
presenti
numerosi "proto-spacers",
ognuno conferisce
immunità
ad un fago diverso
geneticamente
la regione CRISPR
un ceppo starter,
aumentando
il numero di proto-spacers
e qunidi
lo spetro
di resistenza
a fagi diversi
i batteriofagi
per crescere, moltiplicarsi
sottraggono l'energia
alla cellula infettata
e pur non considerandoli
organismi,
considerarli vivi,
questi sono
entità biologiche
perchè
sono costituite
da materiale organico,
si replicano
all'interno di cellule
Mu
forma a siringa,
capside semisferico, poliedrica
un canale,
e delle spike,
(zampette)
che riconoscono
dei recettori specifici
sul batterio,
ed ho quindi fagi
che sono
specie-specifici
ed altri ceppo-specifici,
e una volta che
i recettori
riconoscono il recettore,
ho la struttura tubulare
che funziona come
una siringa,
e è iniettato
l'acido nucleico
nel citoplasma
del batterio)
(dove ha riconosciuto
un recettore specifico)
(in DNA virale
conterà dei promotori,
che sono riconosciuti
dall'RNA polimerasi
della cellula ospite,
e questa RNA
inizierà a trascriver,
e poi il ribosoma
a tradurre
i geni virali,
e tra questi ci saranno
i geni che serviranno
alla duplicazione
del genoma virale,
per cui ni poco tempo
tutta l'energia
della cellula,
sarà convogliata
nella sintesi
di proteine virali
e genoma virale)
(la lisi spesso
è mediata da
proteine fagiche,
che sono batteriolisine)
portano all'uscita
dei virus
altre volte
abbiamo la morte
e l'autolisi della cellula
come vedo se
una popolazione batterica,
è infettata da un fago
o se voglio studiare
un batteriofago
come faccio
a monitorare la crescita,
contare il numero
di particelle fagiche
e mantenuto
a T° di 45-50°C,
e a questa T°
e si possono inoculare
le cellule batteriche
che per poco tempo
l'agar è sciolto,
possono resistere
a questa T°
e si aggiunge
la sospensione fagica diluita
si versa,
si fa solidificare,
e si fa incubare
le cellule batteriche
cresceranno
formando una patina
e in ogni punto,
dove è stato
rilasciato un batteriofago,
ho che questo
infetterà ogni
singola cellula,
e poi inizia
ad infettare
le cellule vicine,
formando zone
trasparenti, circolari
dette placche di lisi,
e contando ogni placcha
corrisponde,
ad ogni singola
particella fagica
presente nella miscela
iniziale
ho una curva
simile a quella
della crescita microbica
ii virus
non si possono contare
perchè tutti dentro
le cellule)
in questa fase
ho l'eclissi
e maturazione
dove ho prodizione
enzimi precosi
e acidi nucleici
(servono
alla divisione
degli acidi nucleici)
ho la produzione
di proteine
che servono
a costruire i capside
e per ultimo
ho quelle che servono
per l'assemblaggio
e rilascio
del virione dalla cellula
(T4 attacca E. coli, e riconosce i lipidi A)
lo possono fare
anche virus animali,
come i retrovirus,
(categoria virus dell'HIV);
e sono virus
che sono capaci
di rimanere latenti
nel genoma
del batterio,
per molti anni
(a seconda
di condizioni
ambientali
metaboliche
della cellula ospite)
(ed è replicato
ogni volta che
la cellula si replica)
dove ho il DNA virale
replicato,
se ho un fago che fa,
che fa solo
ciclo litico,
alla fine avrò
che ucciderà
tutte le cellule presenti
in quell'ambiente,
a meno che
non emergano
dei mutanti resistenti
(che mi causerebbero
gravi perdite economiche,
non ottengo
la trasformazione
che mi interessa)
starter,
(ambiente pulito)
(sistema di ricerca,
studi
su batteri lattici
per capire
meccanismi
di resistenza ai fagi,
e sfruttare
questi meccanismi
di resistenza
per sviluppare,
fare starter
sempre più insensibili
ai batteriofagi,
da questa ricerca,
che è nata
per le tecnologie alimentari,
e stato scoperto
il sistema CRISP-Cas,
che poi è stato usato
come strumento genetico,
ed ora è alla base
di tantissime biotecnologie,
che servono
anche per vaccini
o terapia genica,
e per cui
è stata
una grandissima scoperta,
di questo sistema CRISP-Cas
nei batteri lattici,
che ha portato
avanzamenti della conoscenza
in campo del foood,
biologia,
medicina)
cosa succede
in batteri lattici con
questo sistema
se avviene
e qunidi ho
ho del DNA,
poi poniamo che,
è costituito
da alcuni geni,
detti geni Cas,
poi ho del DNA leader,
poi una regione
di DNA
in cui avrò
delle sequenze
che sono ripetute
identiche
ogni 4-5 nucleotidi
un batteriofago,
infetta la cellula batterica,
e a questo punto,
succede che
il genoma
poterebbe essere
riconosciuto
come estraneo
del sistema Cas
e tagliato,
e ciò succede
se all'interno,
se tra le sequenze
ripetute,
è presente
una piccola sequenza
omologa al genoma
(è detto un protospacer)
l'integrazione
di un pezzettino
del DNA virale,
tra una sequenza
ripetuta
ed un'altra,
e il genoma del fago
viene tagliato
un'altra infezione,
dovuta ad un altro
batteriofago
che contiene
questo stesso
pezzetto di DNA,
questo batteriofago
non potrà infettare,
perchè il sistema Cas
lo riconosce,
e lo taglia,
invece,
un'infezione con
un batteriofago
che non contiene
questa sequenza
è una infezione produttiva,
per cui questo batteriofago
sarà in grado
di produrre
una infezione proficua
inoltre se,
ho una inflazione
da batteriofago iniziale,
che ha subisce una mutazione
qunidi avrà
una mutazione
nel protonspacer,
a questo punto
non potrà
più essere riconosciuto
e avremo
una infezione produttiva
e lo degrada
dal sistema CRISP
quindi durante una infezione,
se cambiano i batteriofagi,
in ogni infezione,
può succedere che
venga inserito
un nuovo pezzetto,
e qunidi un batterio
può diventare resistente
a batteriofagi diversi
con sanificazione
mediante spray
di cocktail fatici,
uso di imballaggi bioattivi
LISTEX
preparazione commerciale
di fagi,
che può essere spruzzata
su vari prodotti alimentari
al fine di ridurre
il rischio
di malattie infettive
ed è approvato
dalla FDA
visto che
il batteriofago
è specifico
per quel determinato batterio,
determinata specie,
io posso usare
un batteriofago,
che mi va a colpire
il batterio alterativo
o patogeno,
ma non mi colpisce
lo starter
contiene un mix
di batteriofagi,
spruzzato
su prodotti alimentari
per ridurre l rischio
di contaminazione
contro la listeria monocitogenes
e questi mix,
di batteriofagi,
possono essere usati
in combinazione
incapsulati
negli imballaggi
qunidi posso avere
un utilizzo pro-tecnologico,
perchè posso selezionare
quelli attivi
contro i batteri alterativi,
e patogeni,
ed usarli come
conservanti
come possono essere usati i batteriofagi,
si sequenziano,
si caratterizzano,
cerco i litici,
quelli che
non sono capaci
di fare ciclo lisogeno,
poi si va a vedere
quali sono
più attivi,
contro le specie patogene,
si producono dei cocktail,
e si usano
per il controllo
dei patogeni alimentari
perchè alla fine,
sono conservanti
naturali
biologici
e visti positivamente
dal consumatore
3 studi presi in considerazione, di applicazioni biotecnologiche per rimuovere biofilm
il biofilm nell'industria aliemntare
il biofilm
il biofilm è una
comunità batterica
inclusa in
una matrice polimerica
extracellulare
prodotta
dai batteri stessi
è costituito
da proteine
polisaccaridi,
acidi nucleici
in una foto vediamo
al microcopio,
cellule batteriche luminose,
incapsulate
in aree celesti chiare,
che è la matrice
del biofilm
prodotte dai
batteri stessi
ed è molto importante
perchè evita
la dispersine
di batteri nell'ambiente,
concentra
i nutrienti
previene l'essiccamento
del biofilm
e inoltre,
i biofilm batterici
limitano l'ingresso
di antimicrobici
(disinfettanti
antibiotici)
è un biofilm polimicrobico,
quando si forma
nei macchinari,
causa dei problemi
economici,
igienico sanitari
in quanto è
resistente agli agenti
antimicrobici
e ai detergenti
e può contenere
microrganismi diversi,
alterativi,
ma anche patogeni
e ciò significa che,
questi patogeni
li ritroviamo
nel prodotto finito
ed è qunidi
un problema serio
qunidi nell'industria,
bisogna avere livelli
igienico-sanitari elevati
e se ho una contaminazione
intervenire subito
con la sanificazione profenda
in quanto difficili
da rimuovere
(richiedono
uso massiccio
di prodotti per sanificazione)
caso 2, lavoro 2:
caso 3:
caso 1, lavoro 1:
presa in esame
la curvacina o sakacina A
che è una batteriocina
una molecola
ad attività antibatterica
prodotta da
lactobacillus sakei
è una battericina
molto attiva contro
listeria monocitogenes,
un importante
patogeno alimentare
lo scopo del lavoro
era testare
il lactobacillus sakei,
capacie di produrre la sakacina,
in biofilm
prodotti su
superfici industriali,
usando questo batterio
prima cosa:
sono presi in considerazione
diversi ceppi di listeria
e si è andata
a studiare
la capacità di
produrre il biofilm,
da parte di
questi ceppi di listeria,
qunidi il biofilm,
è fatto crescere prima
su acciaio inox
e sia su politetrafluoroetilene (PTFE)
e si è visto dei ceppi
quello che era
più capace
di produrre biofilm
e si è visto che
ceppo FBUNT
riusciva a produrre
un ceppo molto consistente
ed è stato scelto
come microrganismo
tester,
di modello
per gli studi successivi,
il primo esperimento,
era volto a capire
se le batteriocine prodotte
da lactobacillus saki,
era capace di rimuovere
un biofilm
di listeria
qunidi sono stati
fatti crescere
dei biofilm di listeria,
su supporti di
acciaio inox,
e di plastica
poi trattati
con batteri lattici
quindi con
lactobacilli saki,
produttore di battericina
o con la stessa
batteriocina,
ma purificata
e poi sono analizzate
e cellule rimaneste,
a 0 e 6 ore dal trattamento
in un altro esperimento,
sono fatti dei saggi di esclusione,
ed è fatto crescere
un biofilm di
batteri lattici,
poi il biofilm è
messo in contatto
con listeria,
e si è visto se
la presenza
di un biofilm
di batteri lattici
poteva prevenire
la formazione di biofilm
da parte di listeria
e in certa misura,
è vero che
la produzione di
un biofilm,
su una superficie,
impedisce
riduce,
la formazione di biofilm,
da parte di listeria,
anche se si trovano
cellule di listeria
poi è stato fatto
un saggio di competizione
in cui si è visto che,
se mescolo listeria
e lactobacillus sakei,
e faccio formare
il biofilm,
c'è uno dei 2 che vince
vince sempre
il Lactobacillus sakei,
per cui ho sempre
una riduzione
del numero di listeria,
quando è fatto
un biofilm
in cocultura
con batteri lattici,
rispetto al biofilm
di listeria pura
qunidi questo studio,
ci dice che
l'utilizzo di starter,
produttori di batteriocine
come Lactobacillus sakei
permette di
limitare
la crescita
e lo sviluppo,
di patogeni come
listeria
ed è un metodo
già usato in modo inconsapevole
nei caseifici artigianali
qunidi,
una nuova possibilità
tecnologica,
è produrre biofilm
buoni,
in impianti industriali,
in modo
da avere una popolazione,
di batteri lattici
produttori di batteriocine,
contro listeria,
per cui listeria
non contamina l'alimento
fermentato
in questo caso,
qunidi il batteriofago T7
è presa in esame,
poi ho un altro controllo,
la possibilità di
usare i batteriofagi
per disperdere
il biofilm prodotto
in questo caso,
da E. Coli,
si è partiti,
da batteriofago T7,
ed è stato modificato
geneticamente,
in modo da esprimere,
il Gene 1-2 di T3
perchè E. coli
è naturalmente resistente
al fago T7,
però diventa sensibile
se il fago
produce il gene T3,
è stato trasformato
in un batteriofago
modificato,
in grato da infettare
E.coli
grazie all'inserimento
del gene T3 1-2,
e in più è aggiunto
il gene dspB
che codifica per un enzima,
da dispersina,
un enzima
in grado di tagliare
la matrice polisaccaridica,
quindi è una carboidrasi,
che taglia la matrice
polisaccaridica
del biofilm di E.coli
che è un fago T7,
che ha il gene t3 1-2
ma non ha
il gene dspB
poi hanno visto,
l'effetto di questo batteriofago
sul biofilm,
e si vede che
il biofilm di E. coli
trattato con ceppo
wialtipe di T7
o non trattato
produce un biofilm
molto consistente,
prerchè T7 non può
infettare E. coli
ma sen inserisco
l gene T3,
o uso il batteriofago T3,
ho una quasi completa
degradazione
del biofilm,
e poi faccio il confronto
tra il T7 controllo,
ovvero il T 7
con il gene T3
ma senza il gene dspB
e poi l'altro è il T7
con espressione
del gene dspB
l'esperimento ci dice,
che è possibile
ingegnerizzare un batteriofago,
in modo che
cambi
la specificità d'ospite,
il T7 naturale
non infettava
E.coli,i
l T7 controllo,
grazie all'inserimento
del gene 1-2 di T3
è in grado di infettare
E.coli,
e aggiungendo gene dspB
un enzima che taglia
il biofilm,
faccio in modo che
il batteriofago
possa penetrare
più profondamente
nella matrice
del biofilm
e così faccio in modo
che ottengo contemporaneamente
l'uccisione
delle cellule
grazie all'infezione
fagica
e la dispersione
del biofilm
dovuta all'azione
di questo enzima,
qunidi conclusione:
i batteriofagi
hanno sia vantaggi
che svantaggi,
per le loro possibili applicazioni
in ambito industriale-biomedico,
e i svantaggi sono
che il batteriofago
ha una certa specificità
d'ospite
e qunidi
non potrebbe essere attivo
contro contaminati
tutti i batteri
alterativi,
i batteri possono sviluppare
una resistenza ai batteriofagi
e comunque,
l'uso di batteriofagi,
per la pulizia
degli impianti di produzione,
potrebbe essere
efficacie
nei confronti del biofilm,
ma potrebbero
generarsi varianti
che attaccano
i batteri starter
uso di enzimi
per rimuovere
il biofilm,
il biofilm è costituito
da esopolisaccaridi,
inclusa la cellulosa
e polisaccaridi
a base diglucidica
e proteine
qunidi hanno preso
in considerazinoe
delle proteasi,
delle alfa amilasi,
e un mix
di cellulasi,
ed emicellulasi,
in grado di degradare,
la matrice polisaccaridica
del biofilm,
e questi enzimi,
sono stati testati
contro
pseudomonas fluorescens
bacillus cereus,
bacillus mycoides
(gram-negativo)
(gram-positivo)
(gram-positivo)
e sono tutti
patogeni alterativi
l'effetto di
questi enzimi,
è stato testato
in 2 condizioni culturali,
n presenza di PBS
(tampone salino)
e di REALCO B
che è un detergente
per la pulizia
di impianti industriali
sono fatti crescere
i biofilm,
delle diverse specie,
su supporti ni acciaio,
poi il biofilm
è inserito
nella macchina,
ed hanno fatto partire,
l ciclo di procedura cip,
usando parametri
tipicamente usati,
nei lavaggi cip industriali,
(es. 68 L/h per 30 minuti a 45°C)
hanno usato tutte le combinazioni
biofilm di
pseudomanas fluorencens,
bacills cereus,
e bacillus mycoides,
e fatti crescere
in 2 terreni
1 a base di carne,
1 di latte,
e poi lavati
con 2 tipi di tamponi,
il REALCO B e PBS
dopo il trattamento
le piastrine di acciaio
sono rimosse,
ed è contata
il numero di cellule
rimaste sulla superficie