BATTERIOFAGI

curva crescita batteriofagi

strategia anti-batteriofago

tesi su approcci tecnologici per la rimozione del biofilm nell'industria alimentare

i batteriofagi possono essere usati per contrastare la crescita di microrganismi patogeni o alterativo

infezioni di un fago lisogeno (o temperato)

sistema CRISP-Cas

sistema CRIP-Cas

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conta di particelle fagiche: il metodo delle placche

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la particella virale

i batteriofagi

come tutti i virus,

tipi batteriofagi

i batteriofagi

sono considerati

le entità biologiche

più abbondanti

in natura,

superando numericamente

i batteri

di circa 10 volte

sono parassiti intracellulari

obbligati;

non possiedono

le informazioni

genetiche

che permettono

la produzione

di energia metabolica

e la sintesi proteica

matura

si chiama virione

ed è costituita

da una molecola

di acido nucleico

(DNA a singola

o doppia elica,

RNA)

rivestita da

un involucro proteico

chiamato capside

si classificano

in base al contenuto

di acidi nucleici

e alla struttura

del virione

ad RNA

i più conosciuti e diffusi:

a DNA a singolo filamento

MS2

Phi 6

a singolo filamento

a doppio filamento

Phi X174

e fd, M13

(più lungo)

(esagonale)

(esagonale con membrana esterna)

(esagonale e su ogni punta una membrana sferica)

DNA a doppio filamento

lambda

T3,T7

T2,T4

image

infezioni di un fago a ciclo litico

alcuni fagi

in base

a questo punto,

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il batteriofago

alcuni fagi lisogeni,

riconosce

specifici recettori

situati sulla superficie

del batterio

e inietta

il suo acido nucleico,

mentre l'involucro proteico

rimane all'esterno

il genoma fagico

può seguire

due vie

a litica

o lisogeno

possiedono solo

il ciclo litico,

ma latri alternano

ciclo litico

e ciclo lisogeno

mutando,

perdono la capacità

di produrre

anche un ciclo litico

e rimangono integrati

nel genoma batterico,

contribuendo

alla sua evoluzione

ciclo litico:

ciclo lisogeno:

il fago

utilizza l'apparato

di replicazione

dell'ospite

per produrre

nuove particelle

fagiche,

fino al momento

in cui la cellula

si disgregherà per lisi,

liberando

centinaia di particelle

fagiche

un batterio

lo stato di profago

in questo stato integrato,

e la disattivazione

il genoma fagico

si integra

nel cromosoma batterico

il fago

viene chiamato

profago,

e ogni qual volta

il cromosoma batterico

si replica,

il genoma integrato

si replica anch'esso

che contiene

un profago

è detto "lisogeno"

e risulta immune

dall'attacco

di fagi

della stessa specie

è mantenuto

da una specifica

proteina

prodotta dal fago stesso

di questo repressore

induce

il ciclo litico

alla classe del virus

ho un genoma nel virione

2) virus a RNA

3) RNA <-->DNA virus

1) virus a DNA

2) RNA ss, RNA ds

3) SS RNA (retrovirus), ds DNA (espanavirus)

1) DNA ss, DNA ds

2) penetrazione (iniezione)

3) sintesi

1) attacco (adsorbimento)

ho il virione con il DNA

che si attacca

alla cellula ospite

il rivestimento proteico

e il DNA virale entra

rimane all'esterno

dell'acido nucleico

e delle proteine

4) assemblaggio

e impacchettamento

(si creano virioni con il DNA)

5) rilascio (lisi)

si rompe

la membrana della cellula

ed escono

i nuovi virioni con DNA,

pronti ad infettare

nuove cellule

image

la qualificazione

e si aggiungono

uso il metodo placche, s(simile alla semina su piastra di popolazione microbica)

image

2) inoculo

1) porre la miscela

ho uno stato in cui,

sulla superficie

di una piastra

di agar nutritivo

in una fiala

(ho una miscela

contenente

lo strato superiore

di agar sciolto

e poi ho una

piastra di agar nutritivo

ho "sandwich"

formato dallo

strato superiore

di agar

e dall'agar nutritivo

sulla piastra avrò

lo strato di

cellule ospiti

e le placche fagiche

del titolo virale

è eseguita

tramite la

conta delle placche

i virioni

a una piccola quantità

di agar fluida,

contenente

una coltura

di batteri sensibili,

il quale è poi

uniformemente distribuito

sulla superficie

di un terreno solido

contente agar

la miscela

viene lasciata solidificare

e si ha un periodo

di incubazione

dei batteri

durante il quale

questi crescono

e formano

uno strato torbido

visibile

ad ochio nudo

dovunque abbia inizio

un'infezione virale

produttiva,

avverrà la lisi

delle cellule infettate,

e si potrà osservare

una zona

più chiara

ovvero la piccola

dal numero di placche

prodotte

si può stimare

il titolo virale,

espresso come CFU

(unità formanti colonia)

e conteggio virale relativo

(unità formanti placche)

appena aggiungo il virus, (asse y)

in funzione tempo (asse x)

poi ho assemblaggio e rilascio

ho un periodo di latenza,

(ho stesso

conteggio virale,

(conteggio virale aumenta)

poi fase latenza)

iniezione

ho 2 strade,

ho l'attacco (adesione)

image

(del virus temperato con DNA

sulla cellula (ospite))

(rivestimento proteico

rimane all'esterno)

(nella cellula ho i 2 DNA)

via litica:

via lisogenica:

il DNA virale

si replica

ho la sintesi

delle proteine

del rivestimento,

e sono assemblate

le particelle virali

ho la lisi,

(rottura parete cellulare

e uscita del virus temperato)

il DNA virale

è integrato

nel DNA dell'ospite

ho la cellula lisogenizzata

(il DNA virale

integrato in quello

dell'ospite

e detto profago)

ho la divisione cellulare

(ottengo 2 cellule figlie)

in determinate condizioni

posso avere poi

il ciclo litico

una induzione

poi ho la sintesi

delle proteine

del rivestimento,

e sono assemblate

le particelle virali

ho la lisi,

(rottura parete cellulare

e uscita del virus temperato)

principali strategie batteriche

per evitare infezione fagica,

grazie

allo sviluppo di

metodi sempre più

specifici

per caratterizzare

e analizzare

i fagi,

è possibile sviluppare

strategie per prevenire

o contrastare

l'infezione fagica

nei processi industriali

in processi industriali,

utilizzo di starter

trattamenti

chimici

e fisici

per decontaminare

l'impianto industriale

rotazione

delle specie batteriche

insensibili

ai batteriofagi

(BIM, bacteriophages insentive mutant)

di resistenza ai fagi:

degradazione

matrice extracellulare

mutuazione

dei recettori riconosciuti

dai fagi

il fago

per iniziare l'infezione

deve legarsi

in modo specifico

ad un recettore

presente sulla superficie

del batterio

(es. propina,

proteine del pilo

o del flagello)

un recettore maturo

non è riconosciuto

dal fago

qunidi il batterio

con questa mutazione

diventa resistente

al fago,

batterica

(la capsula e/o

il biofilm

creano

una barriera

tra fago

e recettore)

dell'acido nucleico virale

prima che possa

avvenire

la replicazione

(es. il sistema CRISP-Cas)

parte integrante

e singole mutazioni

tale batterio

in tale cellula,

è naturalmente

l'acquisizione

cluster di

questo inserisce

clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISP)

nella popolazione fagica

brevi sequenze

di DNA batterico

ripetute,

separate

da sequenze spaziatrici

di origine eterologa,

che mediano

una forma di immunità

acquisita

rispetto a specifici fagi

presente

in molte specie batteriche

e può essere

ingegnerizzato

per ampliare

lo spetro

di resistenza

ai fagi in

culture starter

infettante

può essere

naturalmente presente

un fago mutante,

leggermente difettoso

(attenuato)

il suo genoma

in una cellula

ma non produce

un ciclo litico

efficacie

il DNA fagico

viene degradato

e parti del materiale

genetico

fagico (proto-spacers)

sono incorporate

nella regione CRISPR

tra una sequenza

ripetuta

e l'altra

di tali sequenza

rende il batterio

resistente

verso i fagi

di quella popolazione

produrrà

una progenie resistente

nel genoma del fago

sono sufficienti

ad evolvere

una contro-resistenza

di questo meccanismo

di difesa anti-fago

è l'azione di proteine

CRISPR-associate (CAS)

e i geni codificanti

per le proteine Cas

si trovano solitamene

adiacenti

alla regione CRISPR

nella fase iniziale

dell'invasione virale,

i complessi

di proteine Cas

integrano

i proton-spacers

nella sequenza CRISP

se un fago

attivo

e virulento

infetta un batterio

che contiene

nel suo genoma

una regione di DNA

già presente

in CRISPR,

le proteine CAS

la riconoscono

e degradano

l'intero genoma virale,

impedendo così l'infezione

in una regione CRISPR

è possibile modificare

possono essere

presenti

numerosi "proto-spacers",

ognuno conferisce

immunità

ad un fago diverso

geneticamente

la regione CRISPR

un ceppo starter,

aumentando

il numero di proto-spacers

e qunidi

lo spetro

di resistenza

a fagi diversi

i batteriofagi

per crescere, moltiplicarsi

sottraggono l'energia

alla cellula infettata

e pur non considerandoli

organismi,

considerarli vivi,

questi sono

entità biologiche

perchè

sono costituite

da materiale organico,

si replicano

all'interno di cellule

Mu

forma a siringa,

capside semisferico, poliedrica

un canale,

e delle spike,

(zampette)

che riconoscono

dei recettori specifici

sul batterio,

ed ho quindi fagi

che sono

specie-specifici

ed altri ceppo-specifici,

e una volta che

i recettori

riconoscono il recettore,

ho la struttura tubulare

che funziona come

una siringa,

e è iniettato

l'acido nucleico

nel citoplasma

del batterio)

(dove ha riconosciuto

un recettore specifico)

(in DNA virale

conterà dei promotori,

che sono riconosciuti

dall'RNA polimerasi

della cellula ospite,

e questa RNA

inizierà a trascriver,

e poi il ribosoma

a tradurre

i geni virali,

e tra questi ci saranno

i geni che serviranno

alla duplicazione

del genoma virale,

per cui ni poco tempo

tutta l'energia

della cellula,

sarà convogliata

nella sintesi

di proteine virali

e genoma virale)

(la lisi spesso

è mediata da

proteine fagiche,

che sono batteriolisine)

portano all'uscita

dei virus

altre volte

abbiamo la morte

e l'autolisi della cellula

come vedo se

una popolazione batterica,

è infettata da un fago

o se voglio studiare

un batteriofago

come faccio

a monitorare la crescita,

contare il numero

di particelle fagiche

e mantenuto

a T° di 45-50°C,

e a questa T°

e si possono inoculare

le cellule batteriche

che per poco tempo

l'agar è sciolto,

possono resistere

a questa T°

e si aggiunge

la sospensione fagica diluita

si versa,

si fa solidificare,

e si fa incubare

le cellule batteriche

cresceranno

formando una patina

e in ogni punto,

dove è stato

rilasciato un batteriofago,

ho che questo

infetterà ogni

singola cellula,

e poi inizia

ad infettare

le cellule vicine,

formando zone

trasparenti, circolari

dette placche di lisi,

e contando ogni placcha

corrisponde,

ad ogni singola

particella fagica

presente nella miscela

iniziale

ho una curva

simile a quella

della crescita microbica

ii virus

non si possono contare

perchè tutti dentro

le cellule)

in questa fase

ho l'eclissi

e maturazione

dove ho prodizione

enzimi precosi

e acidi nucleici

(servono

alla divisione

degli acidi nucleici)

ho la produzione

di proteine

che servono

a costruire i capside

e per ultimo

ho quelle che servono

per l'assemblaggio

e rilascio

del virione dalla cellula

(T4 attacca E. coli, e riconosce i lipidi A)

lo possono fare

anche virus animali,

come i retrovirus,

(categoria virus dell'HIV);

e sono virus

che sono capaci

di rimanere latenti

nel genoma

del batterio,

per molti anni

(a seconda

di condizioni

ambientali

metaboliche

della cellula ospite)

(ed è replicato

ogni volta che

la cellula si replica)

dove ho il DNA virale

replicato,

se ho un fago che fa,

che fa solo

ciclo litico,

alla fine avrò

che ucciderà

tutte le cellule presenti

in quell'ambiente,

a meno che

non emergano

dei mutanti resistenti

(che mi causerebbero

gravi perdite economiche,

non ottengo

la trasformazione

che mi interessa)

starter,

(ambiente pulito)

(sistema di ricerca,

studi

su batteri lattici

per capire

meccanismi

di resistenza ai fagi,

e sfruttare

questi meccanismi

di resistenza

per sviluppare,

fare starter

sempre più insensibili

ai batteriofagi,

da questa ricerca,

che è nata

per le tecnologie alimentari,

e stato scoperto

il sistema CRISP-Cas,

che poi è stato usato

come strumento genetico,

ed ora è alla base

di tantissime biotecnologie,

che servono

anche per vaccini

o terapia genica,

e per cui

è stata

una grandissima scoperta,

di questo sistema CRISP-Cas

nei batteri lattici,

che ha portato

avanzamenti della conoscenza

in campo del foood,

biologia,

medicina)

cosa succede

in batteri lattici con

questo sistema

se avviene

e qunidi ho

ho del DNA,

poi poniamo che,

è costituito

da alcuni geni,

detti geni Cas,

poi ho del DNA leader,

poi una regione

di DNA

in cui avrò

delle sequenze

che sono ripetute

identiche

ogni 4-5 nucleotidi

un batteriofago,

infetta la cellula batterica,

e a questo punto,

succede che

il genoma

poterebbe essere

riconosciuto

come estraneo

del sistema Cas

e tagliato,

e ciò succede

se all'interno,

se tra le sequenze

ripetute,

è presente

una piccola sequenza

omologa al genoma

(è detto un protospacer)

l'integrazione

di un pezzettino

del DNA virale,

tra una sequenza

ripetuta

ed un'altra,

e il genoma del fago

viene tagliato

un'altra infezione,

dovuta ad un altro

batteriofago

che contiene

questo stesso

pezzetto di DNA,

questo batteriofago

non potrà infettare,

perchè il sistema Cas

lo riconosce,

e lo taglia,

invece,

un'infezione con

un batteriofago

che non contiene

questa sequenza

è una infezione produttiva,

per cui questo batteriofago

sarà in grado

di produrre

una infezione proficua

inoltre se,

ho una inflazione

da batteriofago iniziale,

che ha subisce una mutazione

qunidi avrà

una mutazione

nel protonspacer,

a questo punto

non potrà

più essere riconosciuto

e avremo

una infezione produttiva

e lo degrada

dal sistema CRISP

quindi durante una infezione,

se cambiano i batteriofagi,

in ogni infezione,

può succedere che

venga inserito

un nuovo pezzetto,

e qunidi un batterio

può diventare resistente

a batteriofagi diversi

con sanificazione

mediante spray

di cocktail fatici,

uso di imballaggi bioattivi

LISTEX

preparazione commerciale

di fagi,

che può essere spruzzata

su vari prodotti alimentari

al fine di ridurre

il rischio

di malattie infettive

ed è approvato

dalla FDA

visto che

il batteriofago

è specifico

per quel determinato batterio,

determinata specie,

io posso usare

un batteriofago,

che mi va a colpire

il batterio alterativo

o patogeno,

ma non mi colpisce

lo starter

contiene un mix

di batteriofagi,

spruzzato

su prodotti alimentari

per ridurre l rischio

di contaminazione

contro la listeria monocitogenes

e questi mix,

di batteriofagi,

possono essere usati

in combinazione

incapsulati

negli imballaggi

qunidi posso avere

un utilizzo pro-tecnologico,

perchè posso selezionare

quelli attivi

contro i batteri alterativi,

e patogeni,

ed usarli come

conservanti

come possono essere usati i batteriofagi,

si sequenziano,

si caratterizzano,

cerco i litici,

quelli che

non sono capaci

di fare ciclo lisogeno,

poi si va a vedere

quali sono

più attivi,

contro le specie patogene,

si producono dei cocktail,

e si usano

per il controllo

dei patogeni alimentari

perchè alla fine,

sono conservanti

naturali

biologici

e visti positivamente

dal consumatore

3 studi presi in considerazione, di applicazioni biotecnologiche per rimuovere biofilm

il biofilm nell'industria aliemntare

il biofilm

il biofilm è una

comunità batterica

inclusa in

una matrice polimerica

extracellulare

prodotta

dai batteri stessi

è costituito

da proteine

polisaccaridi,

acidi nucleici

in una foto vediamo

al microcopio,

cellule batteriche luminose,

incapsulate

in aree celesti chiare,

che è la matrice

del biofilm

prodotte dai

batteri stessi

ed è molto importante

perchè evita

la dispersine

di batteri nell'ambiente,

concentra

i nutrienti

previene l'essiccamento

del biofilm

e inoltre,

i biofilm batterici

limitano l'ingresso

di antimicrobici

(disinfettanti

antibiotici)

è un biofilm polimicrobico,

quando si forma

nei macchinari,

causa dei problemi

economici,

igienico sanitari

in quanto è

resistente agli agenti

antimicrobici

e ai detergenti

e può contenere

microrganismi diversi,

alterativi,

ma anche patogeni

e ciò significa che,

questi patogeni

li ritroviamo

nel prodotto finito

ed è qunidi

un problema serio

qunidi nell'industria,

bisogna avere livelli

igienico-sanitari elevati

e se ho una contaminazione

intervenire subito

con la sanificazione profenda

in quanto difficili

da rimuovere

(richiedono

uso massiccio

di prodotti per sanificazione)

caso 2, lavoro 2:

caso 3:

caso 1, lavoro 1:

presa in esame

la curvacina o sakacina A

che è una batteriocina

una molecola

ad attività antibatterica

prodotta da

lactobacillus sakei

è una battericina

molto attiva contro

listeria monocitogenes,

un importante

patogeno alimentare

lo scopo del lavoro

era testare

il lactobacillus sakei,

capacie di produrre la sakacina,

in biofilm

prodotti su

superfici industriali,

usando questo batterio

prima cosa:

sono presi in considerazione

diversi ceppi di listeria

e si è andata

a studiare

la capacità di

produrre il biofilm,

da parte di

questi ceppi di listeria,

qunidi il biofilm,

è fatto crescere prima

su acciaio inox

e sia su politetrafluoroetilene (PTFE)

e si è visto dei ceppi

quello che era

più capace

di produrre biofilm

e si è visto che

ceppo FBUNT

riusciva a produrre

un ceppo molto consistente

ed è stato scelto

come microrganismo

tester,

di modello

per gli studi successivi,

il primo esperimento,

era volto a capire

se le batteriocine prodotte

da lactobacillus saki,

era capace di rimuovere

un biofilm

di listeria

qunidi sono stati

fatti crescere

dei biofilm di listeria,

su supporti di

acciaio inox,

e di plastica

poi trattati

con batteri lattici

quindi con

lactobacilli saki,

produttore di battericina

o con la stessa

batteriocina,

ma purificata

e poi sono analizzate

e cellule rimaneste,

a 0 e 6 ore dal trattamento

in un altro esperimento,

sono fatti dei saggi di esclusione,

ed è fatto crescere

un biofilm di

batteri lattici,

poi il biofilm è

messo in contatto

con listeria,

e si è visto se

la presenza

di un biofilm

di batteri lattici

poteva prevenire

la formazione di biofilm

da parte di listeria

e in certa misura,

è vero che

la produzione di

un biofilm,

su una superficie,

impedisce

riduce,

la formazione di biofilm,

da parte di listeria,

anche se si trovano

cellule di listeria

poi è stato fatto

un saggio di competizione

in cui si è visto che,

se mescolo listeria

e lactobacillus sakei,

e faccio formare

il biofilm,

c'è uno dei 2 che vince

vince sempre

il Lactobacillus sakei,

per cui ho sempre

una riduzione

del numero di listeria,

quando è fatto

un biofilm

in cocultura

con batteri lattici,

rispetto al biofilm

di listeria pura

qunidi questo studio,

ci dice che

l'utilizzo di starter,

produttori di batteriocine

come Lactobacillus sakei

permette di

limitare

la crescita

e lo sviluppo,

di patogeni come

listeria

ed è un metodo

già usato in modo inconsapevole

nei caseifici artigianali

qunidi,

una nuova possibilità

tecnologica,

è produrre biofilm

buoni,

in impianti industriali,

in modo

da avere una popolazione,

di batteri lattici

produttori di batteriocine,

contro listeria,

per cui listeria

non contamina l'alimento

fermentato

in questo caso,

qunidi il batteriofago T7

è presa in esame,

poi ho un altro controllo,

la possibilità di

usare i batteriofagi

per disperdere

il biofilm prodotto

in questo caso,

da E. Coli,

si è partiti,

da batteriofago T7,

ed è stato modificato

geneticamente,

in modo da esprimere,

il Gene 1-2 di T3

perchè E. coli

è naturalmente resistente

al fago T7,

però diventa sensibile

se il fago

produce il gene T3,

è stato trasformato

in un batteriofago

modificato,

in grato da infettare

E.coli

grazie all'inserimento

del gene T3 1-2,

e in più è aggiunto

il gene dspB

che codifica per un enzima,

da dispersina,

un enzima

in grado di tagliare

la matrice polisaccaridica,

quindi è una carboidrasi,

che taglia la matrice

polisaccaridica

del biofilm di E.coli

che è un fago T7,

che ha il gene t3 1-2

ma non ha

il gene dspB

poi hanno visto,

l'effetto di questo batteriofago

sul biofilm,

e si vede che

il biofilm di E. coli

trattato con ceppo

wialtipe di T7

o non trattato

produce un biofilm

molto consistente,

prerchè T7 non può

infettare E. coli

ma sen inserisco

l gene T3,

o uso il batteriofago T3,

ho una quasi completa

degradazione

del biofilm,

e poi faccio il confronto

tra il T7 controllo,

ovvero il T 7

con il gene T3

ma senza il gene dspB

e poi l'altro è il T7

con espressione

del gene dspB

l'esperimento ci dice,

che è possibile

ingegnerizzare un batteriofago,

in modo che

cambi

la specificità d'ospite,

il T7 naturale

non infettava

E.coli,i

l T7 controllo,

grazie all'inserimento

del gene 1-2 di T3

è in grado di infettare

E.coli,

e aggiungendo gene dspB

un enzima che taglia

il biofilm,

faccio in modo che

il batteriofago

possa penetrare

più profondamente

nella matrice

del biofilm

e così faccio in modo

che ottengo contemporaneamente

l'uccisione

delle cellule

grazie all'infezione

fagica

e la dispersione

del biofilm

dovuta all'azione

di questo enzima,

qunidi conclusione:

i batteriofagi

hanno sia vantaggi

che svantaggi,

per le loro possibili applicazioni

in ambito industriale-biomedico,

e i svantaggi sono

che il batteriofago

ha una certa specificità

d'ospite

e qunidi

non potrebbe essere attivo

contro contaminati

tutti i batteri

alterativi,

i batteri possono sviluppare

una resistenza ai batteriofagi

e comunque,

l'uso di batteriofagi,

per la pulizia

degli impianti di produzione,

potrebbe essere

efficacie

nei confronti del biofilm,

ma potrebbero

generarsi varianti

che attaccano

i batteri starter

uso di enzimi

per rimuovere

il biofilm,

il biofilm è costituito

da esopolisaccaridi,

inclusa la cellulosa

e polisaccaridi

a base diglucidica

e proteine

qunidi hanno preso

in considerazinoe

delle proteasi,

delle alfa amilasi,

e un mix

di cellulasi,

ed emicellulasi,

in grado di degradare,

la matrice polisaccaridica

del biofilm,

e questi enzimi,

sono stati testati

contro

pseudomonas fluorescens

bacillus cereus,

bacillus mycoides

(gram-negativo)

(gram-positivo)

(gram-positivo)

e sono tutti

patogeni alterativi

l'effetto di

questi enzimi,

è stato testato

in 2 condizioni culturali,

n presenza di PBS

(tampone salino)

e di REALCO B

che è un detergente

per la pulizia

di impianti industriali

sono fatti crescere

i biofilm,

delle diverse specie,

su supporti ni acciaio,

poi il biofilm

è inserito

nella macchina,

ed hanno fatto partire,

l ciclo di procedura cip,

usando parametri

tipicamente usati,

nei lavaggi cip industriali,

(es. 68 L/h per 30 minuti a 45°C)

hanno usato tutte le combinazioni

biofilm di

pseudomanas fluorencens,

bacills cereus,

e bacillus mycoides,

e fatti crescere

in 2 terreni

1 a base di carne,

1 di latte,

e poi lavati

con 2 tipi di tamponi,

il REALCO B e PBS

dopo il trattamento

le piastrine di acciaio

sono rimosse,

ed è contata

il numero di cellule

rimaste sulla superficie