Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
ÀCIDS NUCLEICS, 1. PRETRACTAMENT MOSTRES, Centrifugar tub per eliminar el…
-
-
- Centrifugar tub per eliminar el medi
- Sediment resuspent en el tampó de suspensió.
-
-
- Mostres ADN 4-5 dies a 4ºC. Temps superior a 5 dies a -20 ºC
- Mostrs ARN curt temps -20ºC + temps -80ºC
- Netejar la capa de cèl·lules amb un tampó
- Retirar el flascó del medi de cultiu
-
- Desenganxar la monocapa de cèl·lules de la paret del recipient.
-
-
- Recol·lectar les cèl·lules en un tub
- Rentar les cèl·lules abans de continuar amb l’extracció.
-
-
- animal: 10 a 25mg per obtenir de 10 a 40 µg
d’ADN
- vegetal: 100mg a 1g mateixa qt ADN
-
- Fred o inhibidor enzimàtic
-
-
-
-
- Barreja incubació: proteases i detergents
- Mostres petites i talls de teixits en congelació
- Incubadora 37-
56ºC durant 12-24hores
-
-
- Mala qualitat dels àcids nucleics
- Micròtom -> talls 5-10µm teixit
- Transferir 5-10mg de talls en un tub.
3.Incubar seqüencialment amb xilol, etanols de
concentració decreixent i aigua destil·lada
-
- Tampó solució (Tris, EDTA i Glucosa)
- Recullir colònies de la superfície amb nansa de sembrar
- Resuspendre-la en un tampó de solució
- centrifugar la suspensió cel·lular i eliminar sobrenadant
- si microbacteri -> afegir hidròxid de sodi
- detectar presència microorganismes en vies respiratòries
- determina si un àcid nucleic conserva la seva
mida original.
- electroforesis en gel
d’agarosa al 0’7%-1’2% (p/v)
- 1 única banda definida en la part superior
- Si fragmenta -> estela fluorescent
- No aplicable als teixits fixats en formol
-
- Ocasions -> banda fluixa amb estructura relaxada inclús 3a banda corresponent a dímers
- Lleuger amb bandes nítides (ARNr 28s i 18s)
- Ocasions tercera banda dèbil (ARNr 5,5s i 5s i ARNt)
- Absència possibles contaminants
-
- Mostres diluïdes amb aigua destil·lada
- Igual o menor 1,6 -> contaminació per proteïna o fenol
- Superior a 2 -> concentració elevada ARN
-
- inferior a 1,5 -> contaminants
- No tant específic com l'altre
-
-
-
La columna de cromatografia → carrega amb una dilució del lisat en un tampó de baixa salinitat i pH neutre.
- Puresa adequada -> 1,7 a 2
- Aquest valor s'ha de restar de les mesures a 260nm, 280nm i 230nm abans de calcular els
corresponents quocients.
- Quantitat d’àcids nucleics per unitat de volum en la solució final
-
Les proteïnes, polisacàrids i altres contaminants del lisat amb càrrega + no s’uneixen a l’intercanviador i s’elueixen de la columna.
La columna es neteja amb tampons de concentració salina creixent. Es va eliminant contaminats amb una càrrega - dèbil
- 1 u d'abs. = 50 µg/ml ADN bicatenari
- 1 u d'abs. = 33µg/ml ADN monocatenari
-
- 1 u d'abs. = 40 µg/ml ARN
- Mesura en dilució de la mostra purificada
-
Els àcids nucleics → càrrega neta - s’uneixen als grups funcionals de l’intercanviador, càrrega neta +.
-
-
- mostra reacciona amb colorant -> exita amb l. ona -> mesura fluorescència emesa
Fase aquosa→ es transfereix en un tub net i l’ADN precipita afegint acetat sòdic i isopropanol o etanol al 100% fred.
- Centrifugació: eliminar medi cultiu
- Separar ADN i ARN bacterià
- Centrifugació en gradient densitat
- Lisi alcalina: diferències procés desnaturalització/renaturalització
-
-neutralització: macroagregats insolubles que precipiten i ADN plasmídic recupera estructura. Desprñes es centrifuga
-
- purificar productes de PCR amb una mida superior a
150pb.
-
-
-
- Sensible acció ARNases i degradació ràpida
- Treballar en condicions especials
-
-
-
-
- Purificació d’ADN genòmic --> combinació de fenol, cloroform i alcohol isoamilic, en proporcions 25:24:1.
- Barrejar volums iguals de lisat i reactiu i agitar amb un vòrtex - Lisat --> fase aquosa. - El cloroform --> dissol lípids i proporciona fase orgànica. - El fenol --> desnaturaliza i dissol proteïnes del lisat i s’integra en la fase orgànica.
-
- Centrifuga: fase aquosa part superior i fase orgànica part inferior tub
-
Exemples de mostra: Sang, eixit animal, teixit vegetal, teixit FFPE, cultius bacterians, mostres forenses.
-
-
-
-
- Solució precipitant al vòrtex durant 30s .
- Sobrenadant + volum igual d’isopropanol.
- Mesclar per inversió suau.
- Centrifugar: proteïnes en el sediment i sobrenedant AN, sals i components hifdrosolubles del lisat
- Rentar ADN amb etanol al 70-95%
- Ressuspendre amb H2O o TE
-
-
-
- Rentar les cèl·lules amb tampó o SF
