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TEMA 2.1: MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS - Coggle Diagram
TEMA 2.1: MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
1. ENZIMAS DE USO FRECUENTE EN IG
Ligasas
Unen DNA catalizando la formación del enlace fosfoéster
Polimerasas
Sintetizan nuevas moléculas complementarias a una molde, (realizan copias de ac.nucleicos)
Nucleasas
Hidrolizan enlaces fosfodiester
ENZIMAS DE RESTICCIÓN
Enzimas de modificación terminal
Cambios en los extremos de las moléculas de DNA
2. FRAGMENTACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
DNasas inespecíficas
Exonucleasa VII (E.coli)
No precisa cationes metálicos
Exonucleasa 3-5 y 5-3
Eliminación de extremos protuberantes / cebadores de la PCR
ssDNA
Exonucleasa λ
Exonucleasa 5-3
Creación de extremos 3´protuberantes
Mg2+
dsDNA (sobre 5´romo)
Exonucleasa III (E.coli)
Cationes divalentes
Exonucleasa 3´-5 y endonucleasa en los híbridos
dsDNA (sobre 3´OH romos)
Creación de extremos 5´protuberantes marcaje DNA
Nucleasa Bal 31
Cationes divalentes
Acortar extremos del dsDNA
Exonucleasa 3-5 en dsDNA y endonucleasa en ssDNA
dsDNA y ssDNA
Dnasa I
Cationes divalentes
Endonucleasa
dsDNA (<ssDNA)
Eliminar el DNA contaminante y para Nick translation
RNasas inespecíficas
Actividad muy abundante y dificiles de inactivar
RNasa T1
Endonucleasa
Eliminación de regiones de RNA no hibridado
ssDNA
RNasa H
Mg2+
Exonucleasa 5-3 y 3-5/ endonucleasas
RNA en híbridos
Eliminación de RNA en híbridos o para la obtención de cDNA
RNasa A
ssRNA o RNA en híbridos
No requiere cofactores
Endonucleasa
Eliminación RNA contaminante
Clasificación de las nucleasas
Lugar
Exonucleasas
Catalizan la hidrólisis de los nucleótidos terminales en 5-3 o 3-5
Endonucleasas
Reconocen secuencias de bases específicas cortando el enlace interno fosfodiester
Especificidad
No específicas de secuencia
Específicas de secuencia:
ER
Sustrato
RNA
RNA-DNA
cortan el dsDNA y el RNA
DNA
ssDNA y dsDNA
¿Cómo podemos conseguirlo?
Métodos químicos
Hidrólisis alcalina (RNA) o ácida
Métodos enzimáticos
Hidrólisis parcial o total y los fragmentos pueden ser específicos o inespecíficos
NUCLEASAS
Métodos físicos
Fuerza de cizalla, ultrasonidos,etc.
¿Para qué necesitamos fragmentar o cortar los ac. nucleicos?
Frag. inespecíficos
Facilita el manejo de cromosomas
Frag. específicos
Análisis de tamaños/ mapas de restricción
Clonajes dirijidos
Frag. total
Eliminación AN como contaminante
4.POLIMERASAS
5. ENZIMAS DE MODIFICACIÓN TERMINAL
3. LIGASAS