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PRACTICA 8: CINÉTICA ENZIMÁTICA
Paso 1: Preparación del equipo y materiales
Reúne todos los materiales y equipos necesarios, como pipetas, tubos de ensayo, reactores, cronómetros, espectrofotómetro u otros instrumentos de medición, así como las enzimas y sustratos requeridos para tu experimento.
Asegúrate de que todo el equipo esté limpio y calibrado correctamente.
Paso 2: Preparación de las soluciones
Prepara soluciones de enzima, sustrato y cualquier otro reactivo necesario según las concentraciones deseadas. Asegúrate de que las soluciones estén en las condiciones óptimas de pH y temperatura para la enzima que estás estudiando.
Paso 3: Inicio del experimento
Coloca los tubos de ensayo o reactores en el espectrofotómetro si estás midiendo la absorbancia para seguir la reacción. Asegúrate de que los tubos de ensayo estén en blanco antes de empezar.
Paso 4: Medición de la velocidad inicial (v0)
Para medir la velocidad inicial de la reacción (v0), debes empezar a cronometrar inmediatamente después de agregar la enzima al sustrato o viceversa, dependiendo de tu experimento.
Registra la lectura del espectrofotómetro u otro instrumento de medición a intervalos regulares para seguir la reacción a lo largo del tiempo.
Paso 5: Construcción de las curvas de velocidad
Realiza la misma serie de pasos para varias concentraciones de sustrato, manteniendo la cantidad de enzima constante.
Calcula la velocidad inicial (v0) para cada concentración de sustrato midiendo la pendiente de la curva de avance de la reacción en cada caso.
Paso 6: Análisis de los datos
Grafica la velocidad inicial (v0) frente a la concentración inicial de sustrato ([S]0). Deberías obtener una curva que muestra cómo cambia la velocidad con la concentración de sustrato.
Observa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción. A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es directamente proporcional a la concentración ([S]0), lo que indica una cinética de primer orden. A concentraciones elevadas, la velocidad se satura y se alcanza la velocidad máxima (Vmax).
Paso 7: Análisis adicional
Puedes utilizar la ecuación de Michaelis-Menten o Lineweaver-Burk para obtener parámetros cinéticos como la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax) si lo deseas.
Recuerda que estos son los pasos generales y que la práctica real puede variar según la enzima y el sustrato que estés estudiando. Es fundamental seguir las condiciones experimentales óptimas para obtener resultados precisos y significativos.
Materiales
6 matraz aforado de 100 mL
6 Vasos de precipitados altos de 100 mL
Pipeta graduada de 25 mL
Pipeta automática de 200 μL (0.2 mL)
Probeta de 100ml
Conductímetro
Termómetro de -2 a 50 °C
potenciómetro
Parrilla con agitación
Agitador magnético
Reactivos
Urea
Soluciones para calibración de pHmetro; pH 4.0 ypH 7.0
Disolución de Ureasa en Glicerol 50%, 1
000 U/ml500 ml de NaOH 0.2 M500 ml de HCl 0.2 M2 pisetas
IMG 1 Cinética Enzimática
IMG 2 Tabla de disoluciones
IMG 3 Conductimetro
IMG 4 Urea
