Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ D'ÀCIDS NUCLEICS, Esferes recobertes d'…

- - - - HOMOGENITZACIÓ MECÀNICA
        Sometre teixit a acció trituradora
        Automàtica/Manual
        
        AUTOMÀTICA
        Possible alliberació de proteases/enzims que provoquen degradació= Fred/Inhibidors d'enzims
        -Teixit es talla en petits fragments
        -S'homgeneïtza amb instruments (trituradora)
        -Transferir en tub net
        
        MANUAL
        Minimitza el problema de degradació.
        -Cobrir fragments amb nitrogen líquid = permet congelació ràpida + evita formació de cristalls a l'interior de cèl·lula (cristalls poden provocar lisi cel·lular + alliberament d'enzims)
        -Morter es trituren fragments congelats fins aconseguir pols fina
        -Deixar evaporar nitrogen líquid
        -Transferir a u tub net.
      - HOMOGENITZACIÓ QUÍMICA
        Sometre teixit a acció de proteases/detergents = degradació de components tissulars/disgregació de cèl·lula
        Enzims
        
        -Afegir barreja de proteases/detergents = digestió de teixits
        -Incubar a 37-56ºC durant 12-24h
  - - - CULTIUS EN SUSPENSIÓ
        Creixement en suspensió en medi de cultiu líquid
        
        Recolectar en tub + Eliminar medi de cultiu per centrifugació + Rentar cèl·lules amb tampó
      - CULTIUS EN MONOCAPA
        Creixement en capa adherida a paret d'un flascó de cultiu.
        
        UTILITZAR MATEIX FLASCÓ
        -Retirar medi de cultiu
        -Netejar capa de cèl·lules amb tampó
        
        PASSAR LA MONOCAPA A UN TUB
        -Desenganxar monocapa de paret
        -Recolectar cèl·lules en tub
        -Rentar cèl·lules amb tampó
  - - - LISI D'HEMATIES
        Tampó de lisi + centrifugació + eliminar sobrenedant (plasma sanguini + Hb)
        = sediment amb leucòcits
      - CÈL·LULES MONONUCLEADES EN SANG PERIFÈRICA
        Limfòcits/monòcits = Estudi i detecció de VIH
        Centrifugació en gradient de densitat
        Medi poc viscós de separació (manté condicions d'osmolaritat) = Ficoll (causa agregació d'hematies: ràpida sedimentació) + diatrizoat sòdic
        Medi de separació i sang a sobre + centrifugació + eliminar sobrenedant + cèl·lules mononucleades es transfereixen a tub net + rentat amb tampó
  - - - Glopejat amb solució conservadora
      - Raspat de mucosa oral
        Torunda/raspall
        Submergir en solució conservant perquè es desprenguin cèl·lules
      - Saliva
    - - CULTIUS EN MEDI SÒLID
        -Recollir colònia amb nansa de sembrar
        -Resuspensió de colònia en tampó de suspensió
      - CULTIUS EN MEDI LÍQUID
        -Centrifugar per eliminar medi de cultiu
        -Resuspensió de sediment en tampó de suspensió
- - - - INCUBACIÓ AMB SOLUCIÓ DE LISI
        
        EDTA
        Quelant de cations divalents (Ca, Mg)
        Mg necessari per funcionament de ADNases = Inhibició d'activitat de ADNases
        
        PROTEASES
        Proteinasa K
        Facilita trencament/dissolució de membranes/eliminació de nucleases = Digereix proteïnes
        Útil en mostres de teixits frescs i FFPE
        
        DETERGENTS
        Dodecil-sulfat sòdic - SDS
        Desestructura bicapa lípidica + Desnaturalització de proteïnes de membrana
        
        AGENTS CAOTRÒPICS
        Isotiocianat de guanidini = Inactivador de ARNases
        Inactivació de nucleases = Desnaturalització de macromolecules
        Influeixen en l'organització de l'H2O + l'interacció amb macromolecules
        
        Sèrie de Hofmeiser
        Indica l'intensitat de l'efecte caotròpic provocat per sals.
  - - - Presència de grumolls, cossos cel·lulars, etc =
        
        Afegir solució de lisi
        
        Reincubar mostra (37-65ºC)
- - - - .
        
        Elució de l'ADN
        
        S'elueix en tub Eppendorf net
        
        Afegir aigua destil·lada o tampó TE = recuperació de capa hidratant
        
        DESORCIÓ
        
        Ressuspensió per incubació de 3-5 minuts
        
        Eliminació per elució.
        
        Neteja de columna
        
        Càrrega d'etanol 70% per eliminar restes contaminants.
        
        Centrifugació + eliminació de contingut.
        
        Per evitar restes d'alcohol = NOVA centrifugació + eliminació de contingut
        
        Columna de cromatografia
        Membrana de llana de vidre/perles de silici empaquetades en columna de polipropilè.
        
        Càrrega amb lisat diluït en tampó amb agent caotròpic.
        
        Centrifugació = Adsorció d'AN en membrana de columna / proteïnes + components contaminants en medi líquid = ELIMINACIÓ
  - - - PROCEDIMENT
        
        Neteja de la columna
        
        Amb tampons de concentració salina creixent
        = elimina contaminants amb càrrega - dèbil
        
        Elució de l'ADN
        
        S'elueix amb tampó de màxima salinitat + pH alt
        
        Es renta amb etanol
        
        Resuspensió amb aigua destil·lada o tampó TE.
        
        Columna de cromatografia
        
        Càrrega amb dilució de lisat en tampó de baixa salinitat + pH neutre = AN amb càrrega - s'uniràn a grups funcionals d'intercanviador (càrrega +)
        Proteïnes, polisacàrids i altres contaminants de lisat amb càrrega + NO s'uneixen = elució
      - Grups funcionals + utilitzats Metilaminoetanol (MAE) I Dietilaminoetil (DEAE)
  - - - Carregar la mescla de la PCR
        Mescla de reacció de PCR es carrega en columna de centrífuga
        = sobre filtre queden retinguts els productes amplificats de PCR
        = tub col·lector passen contaminants (primers, nucleòtids...)
      - Rentat del filtre
        
        Amb etanol = eliminar restes de contaminants
      - Resuspensió d'ADN
        
        Afegir aigua destil·lada/tampó TE
        
        Incubar a Tº ambient
        
        Tranferir a tub net per pipeteig
  - - - Precipitació de proteïnes
        
        Afegir solució salina concentrada = actua com a solució precipitant de proteïnes
        
        Agitació en vòrtex
        
        Centrifugació = Proteïnes en pellet + sobrenedant AN, sals..
      - Precipitació d'ADN
        
        Sobrenedant es transfereix a tub net
        
        Afegir isopropanol
        
        ADN precipita
        
        Centrifugació = ADN sedimenta a fons de tub + eliminar sobrenedant
      - Rentat i Ressuspensió d'ADN
        
        Pellet d'ADN es neteja amb etanol 70-95%
        
        Ressuspensió amb tampó Tris-EDTA (TE)
  - - - LA CENTRIFUGACIÓ EN GRADIENT DE DENSITAT
        Es basa en la diferència de densitat dels dos tipus de molècules.
        
        Ultracentrifugació en gradient creixent de densitat de clorur de cesi
      - LA LISI ALCALINA
        Es basa en diferencies en el procés de desnaturalització/renaturalització dels dos tipus de molècules (Plasmidis/ADN cromosòmic)
        
        Procediment:
        
        Purificació d'ADN plasmídic
        
        Sobrenedant és transferit a un tub net, es tracta amb ARNases per eliminar ARN contaminant i es purifica per mètodes descrits anteriorment; cromatografia d'adsorció, esferes magnètiques...
        
        Neutralització ràpida
        
        Afegim una solució concentrada d'acetat de potassi (pH=4,8)
        
        ADN cromosòmic origina macroagregats insolubles que precipiten
        
        ADN plasmídic es renaturalitza i recupera estructura, mantenint-se en suspensió.
        
        Alta concentració salina provoca precipitació de proteïnes = atrapen ADN cromosòmic NO renaturalitzat.
        
        Centrifugació = sedimenten tots els components insolubles/ sobrenedant amb ADN plasmídic
        
        Lisi alcalina
        
        Afegim als bacteris en suspensió una solució de lisi molt alcalina de pH=11 = Detergent SDS + hidròxid de sodi.
        
        Es produeix lisi dels bacteris per acció de SDS i la desnaturalització de l'ADN (cromosòmic i plasmídic) per pH alcalí.
  - - - Rentat d'ADN
        
        Pellet d'ADN es neteja amb etanol 70-95%
        
        Centrifugació = Eliminar sobrenedant (resta de sals + possibles contaminants)
      - Precipitat d'ADN
        
        Fase aquosa es transfereix a tub net
        
        Afegir acetat sòdic i isopropanol/etanol al 100% fred
        
        ADN precipita
        
        Centrifugació = ADN sedimenta a fons de tub + eliminar sobrenedant (contaminants hidrosolubles)
      - Eliminació de compostos solubles en DO
        
        Es barreja lisat + reactiu
        
        Agitació en vòrtex
        
        Centrifugació = Obtenció de fase aquosa (AN, sals) + fase orgànica (lípids, proteïnes)
      - Resuspensió d'ADN
        
        Invertir tub en material absorbent (paper de filtre) = Etanol interfereix = eliminar
        
        Deixar assecar a Tº ambient pellet d'ADN
        Ressuspendre amb tampó Tris-EDTA (TE)
  - - - No necessiten cations de magnesi = el EDTA no els inactiva
        
        L'esterilització per calor no elimina les ARNases, ja que es re-nautalitzen quan disminueix la Tº.
        
        ARNases són enzims molt resistens que estan present en la majoria de superfícies
        
        ARN és molt sensible a les ARNases, es degrada ràpidament en contacte
    - - 1. Treballar amb guants en una cabina de flux laminar, per evitar contaminacions
        
        2. Neteja de superfícies amb solucions comercial inactivadores d'ARNases
        
        3. Utilitzar material certificat com a lliure de ARNases
        
        4. La solució de lisi ha de contenir un agent caotròpic que inactivi les ARNases = isotiocianat de guanidini
        
        5. Tots els reactius i l'aigua destil·lada (amb el mètode DEPC = dietilpirocarbonat) han d'estar lliures d'ARNases
        
        Cal autoclavar per eliminar el DEPC.
        
        DEPC modifica aminoàcids de proteïnes (histidina, lisina, cisteina, tirosina) les quals inactives les ARNases.
- - - - CÀLCUL DE CONCENTRACIÓ
        Corba de calibratge amb quanitats de ADN conegudes.
        Els patrons de la mostra es fan reaccionar amb els colorant, s'exciten amb la longitud d'ona adequada i es mesura la fluorescència emesa.
        El valor de fluoresència obtinguda en la mostra problema s'intercala en la cobra de calibratge per conèixer la concentració d'ADN.
        
        CONVERSIÓ D'UNITATS: Algunes vegades es dona la concentració d'àcids nucleics en µg i altres picomols (pmols).
        Igualtats a tenir en compte:
        
        1pb (Parell de Bases) = 660 pès molecular
        
        1 nucleòtid = 330 pès molecular
        
        ADN de doble cadena: (on N és el número de parells de bases)
        
        De picomols a µg: µg = pmol x N x 660/10^6
        
        De µg a picomols: pmol = µg x 10^6/N x 660
        
        ADN monocatenari: (on N és el nombre de nucleòtids)
        
        De picomols a µg: µg = pmol x N x 330/10^6
        
        De µg a picomols: pmol = µg x 10^6/N x 330