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COLTURE CELLULARE - Coggle Diagram
COLTURE CELLULARE
l'uomo nei prossimi anni dovrà affrontare e trovare delle soluzioni ai problemi:
sfamare la popolazione mondiale
ridurre gli effetti dell'inquinamento
riduzione delle fonti di combustibili fossili
le piante possono aiutare a rispondere a queste necessità:
-depuratori ambientale
fitorimedio
fonte di molecole bioattive, amento della produzione (selezione e biotecnologie)
produzione di biocarburante bioplastiche e altri prodotti industriali
COLTURE IN VITRO
rigenerazione di piante
la
totipoienza
: la possibilità di rigenerare un intera pianta da porzioni di tessuti o di organi da singole cellule anche differenziate e da protoplasti
non si puo fare in caso di morte cellulare o perdita del nucleo
espianti
: cellule vegetali o frammento di tessuti o organi di pianta che vengono utilizzati per dare inizio alla coltura in vivo
parametri chimico-fisici
luce
: (composizione spettrale, intensità e fotoperiodo)
T°
composizione chimica del mezzo
nutrienti minerali, carboidrati , vitamine, regolatori di crescita)
PH
densita della popolazione cellulare
n° cellule / volume
preparazione pratica del mezzo di coltura:
macroelementi: C,H,N,P,S,K,Mg,Ca
microelementi: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Mo, Cl
vitamine
auxine
citochinine
zucchero
agar
PH
base salina Murashige and Skoog 1962
I
macroelementi
sono necessari in quantità elevate,
millimolari,
perché hanno un ruolo prevalentemente strutturale, es. l’azoto, il potassio e il fosforo che partecipano alla formazione di metaboliti primari come proteine, acidi nucleici, pigmenti fotosintetici e ormoni, ma sono anche presenti nella composizione di metaboliti secondari.
I
microelementi
sono richiesti in quantità ridotte o in tracce, micromolari, hanno principalmente un’attività catalitica, es. ferro, zinco, cobalto sodio, cloro, manganese molibdeno .
Il ferro è il più critico tra i microelementi
mezzo B5 Gamborg,
prima della sterilizzazione si deve controllare il
PH
che dovrà essere tra 5.2 e 6.0
esso puo' influenzare:
solubilità dei sal --> assorbimnto dei nutrienti
solidificazione dell'agar
il mezzo di coltura puo' essere sia liquido che solido se aggiungiamo nel mezzo agar o derivati sintetici
nel liquido si utilizza prevalentemente pe cellule isolate protoplasti, organi e embrioni avventizi ed isolati
storia : le culture in vitro delle cellule e tessuti vegetali ebbero inizio nel 900'. si inizi con dee radici di pomodoro per poi passare a frammenti di fusto di saliche che in presenza di basse concentrazioni di auxina davano origine al
callo
( masse di cellule indifferenziate)
SOSPENZIONI CELLULARI
Formate da popolazioni di cellule e piccoli aggregati cellulari coltivati in un mezzo liquido, mantenuto in agitazione mediante agitatore orbitale.
l'agitazione previene l'aggregazione tra le cellule e garantisce il contato con l'ossigeno e i nutrienti in modo uniforme
per rispondere alla domanda quanto dura una coltura cellulare liquida devo vedere la curva di crescita: la rappresentazione su piano artesiano dell'incremento di biomassa nel tempo
Le colture in vitro delle cellule e tessuti vegetali ebbero inizio nei primi anni del 1900, quando si osservò che era possibile coltivare per tempi piuttosto lunghi radici di pomodoro su un terreno artificiale, dopo averle rimosse dalla pianta. Quasi contemporaneamente fu dimostrato che un frammento di fusto di salice, era in grado di crescere su un mezzo analogo ma con l’aggiunta di una bassa concentrazione di auxina. L’espianto in queste condizioni poteva dare origine ad una massa di cellule indifferenziate (callo).
Per le cellule coltivate in vitro
è importante valutare la vitalità,
questo permette di capire se la coltura è in buona salute o se qualche parametro deve essere modificato.
I saggi di vitalità cellulare servono proprio a discriminare le cellule vive da quelle morte di una coltura. Si basano sull’utilizzo
di coloranti vitali,
il colorante viene somministrato alle cellule prelevate dalla coltura e in base alla colorazione assunta, o al segnale di fluorescenza emesso, dalle cellule si può stabile il loro stato di salute.
La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di riemettere (nella maggior parte dei casi a lunghezza d’onda maggiore e quindi a energia minore) le radiazioni elettromagnetiche ricevute, in particolare di assorbire radiazioni nell’ultravioletto e riemetterla nel visibile
le applicazioni delle colture cellulari:
Biotecnologiche
:
produzione di
metaboliti
propagazione industriale di piante ad interesse agronomico industriale
ricerca di base
studio della biologia cellulare e dello sviluppo
ricerca applicata all'ambiente
per ottenere piante con caratteri adeguati a particolari condizioni ambientali
propagazione di ibrifi
valutazione difattori ambientali su processi filologici delle piante anche singolarmente
GLI ORMONI VEGETALI
AUXINE E CITOCHINE. partecipano alla regolazioni di moltissime funzioni tra cui il ciclo cellulare controllando l'attività dei completi chinasi-ciclica-dipendenti
es. la carenza di auxina provoca l'arresto in fase G1 la carenza di citochinine provoca la carenza in fase G2
tipo e concentrazione di auxina inel mezzo di coltura possono favorire mutazioni somatoclonali
sovra espressione del gene per la citochininaa ossidasi (ridotti livelli di citoichinine) in tabacco.
ritardo nello sviluppo del germoglio dovuta alla riduzione della velocità di proliferazione cellulare del meristema apicale
aumento della velocità di crescita della radice dovuta ad un aumento di proliferazione del meristema radicale
La micropropagazione è un importante metodo di propagazione delle piante che sta diventando sempre più rilevante nell'ambito dell'agricoltura sostenibile. Le sue applicazioni sono ampie e offrono diversi vantaggi)
Produzione in Serie e Clonazione Genetica:
La micropropagazione consente di produrre un gran numero di piante geneticamente identiche (cloni) a partire da una pianta madre. Questo è particolarmente utile in settori come la frutticoltura, dove la riproduzione precisa è essenziale per mantenere le caratteristiche desiderate delle piante.
Salute Vegetale e Riduzione di Prodotti Chimici:
La tecnica è fondamentale per garantire la salute del materiale vegetale, riducendo la necessità di interventi intensivi con prodotti fitosanitari. Ciò contribuisce a ridurre l'uso di pesticidi e a migliorare la sostenibilità ambientale.
Uniformità e Programmabilità:
Le piante micropropagate rispondono in modo uniforme alle condizioni ambientali, consentendo interventi mirati e programmabili. Questo è prezioso per ottimizzare la produzione agricola e ridurre gli sprechi.
Riproduzione di Specie Difficili:
La micropropagazione è utilizzata per riprodurre specie vegetali difficili da propagare o con una crescita lenta. Ciò consente di preservare e propagare piante rare o preziose.
Riduzione di Prodotti Fitofarmaceutici
: Durante i primi anni di crescita delle piante micropropagate, è possibile ridurre l'uso di prodotti fitosanitari, contribuendo alla sostenibilità fisica e ecologica.
Benessere degli Operatori
: La produzione in laboratori di micropropagazione avviene in ambienti controllati e protetti, migliorando il benessere degli operatori rispetto alle condizioni di campo.
Biodiversità e Futuro Sostenibile: I laboratori di micropropagazione svolgono un ruolo importante nel mantenimento della biodiversità vegetale e nella produzione di piante di interesse futuro, come cloni per la produzione di biocarburanti, materiali per la produzione di sostanze terapeutiche e altro.
colture in vitro parte pratica
Scelta dell'
ESPIANTO
In teoria qualsiasi parte della pianta (organo, tessuto, o poche cellule) è in grado di proliferare e dare origine a una pianta intera.
In pratica si deve operare una scelta
dell’espianto perchè
non tutte le cellule/tessuti danno la stessa risposta,
il prodotto finale è legato a ciò che viene messo in coltura.
la morfogenesi può essere indotta in tutte le specie di piante anche s all'interno della stessa specie ci possono essere varietà recalcitranti.
le celule dell'espiento in grado di dare origine a organi sono dette
competenti
la competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo: una che è competente per lo sviluppo di un'embrione somatico non lo è anche per lo sviluppo di un germoglio
le cellule possono essere
indotte a diventare competenti
aggiungendo nel mezzo di coltura opportuni regolatori di crescita
dai tessuti /organi/cellule in coltura è possibile ottenere:
caulogenesi
--->
germogli
Puoi iniziare con il tessuto di una giovane gemma o apice vegetativo.
rizzogenesi
-->
radici
i tessuto contenenti nodi o tessuto radicale possono essere utilizzati.
neoformazione fiorale
-- fiori
embriogenes somatica
-->
embrioni somatici
che abbiano la capacità di sviluppare nuovi organi floreali, come gemme laterali.
Per ottenere la
caulogenesi
da una coltura cellulare di tessuto di pianta, è necessario coltivare cellule o tessuti che abbiano la capacità intrinseca di formare nuovi germogli. Questo può richiedere la coltura di cellule meristematiche o tessuti contenenti gemme
Per caulogenesi si intende la produzione di germogli avventizi da espianti di diverso tipo o da cellule di callo.
Nel callo alcune cellule possono organizzare
meristemoidi
, gruppi di cellule meristematiche, che successivamente si sviluppano in gemme vegetative.
La caulogenesi permette di produrre piante geneticamente
identiche, cloni, tra loro e rispetto all’espianto di partenza
(pianta madre), se non intervengono eventi di modificazione genetica (non prevede rimescolamento genico) si possono ottenere tanti germogli (future piante)in poco tempo
a cauologenesi si può utilizzare per la produzione di metaboliti secondari.
esempio
hypericum perforatum
viene fatto un espianto dall'epidermide inferiore delle foglie( sono in grado di produrre
ipericina e iperforina
) --> formazione di cellule indifferenziate che non le producono --> germogli rigenerati in vitro possiedono cellule che producono
ipericine e iperforine
si usano cappe. afflusso laminare per non contaminare i campioni
e camere di coltura
caulogenesi
Si pone in coltura un espianto sterile. In generale, tessuti giovani, come apici dei germogli terminali o laterali o avventizi hanno capacità rigenerative migliori. Ottime anche le gemme a fiore immature.
moltiplicazione
Il materiale viene messo a crescere in presenza di elevati livelli di citochinina.
La moltiplicazione dei germogli dipende o dalla continua formazione di germogli ascellari o dalla formazione di germogli avventizi dalle masse di callo alla base dei germogli.
separazione dei germogli e radicazione
(elevati liv auzxina)
ambientamento
plantule vanno nella serra di acclimatazione
posso agire per:
morfogenesi diretta
si verifica quando le cellule o i tessuti coltivati in vitro sviluppano direttamente strutture desiderate senza la formazione di strutture intermedie
Gli organi avventizi si formano da cellule differenziate del
tessuto di partenza senza una fase di proliferazione cellulare.
la
morfogenesi indiretta
coinvolge la formazione di strutture specifiche attraverso la creazione di organi o strutture intermedie, noti come organioidi o organiogenesi Gli organi avventizi si
formano da cellule di callo
EMBRIOGENESI SOMATICA:
formazione di embrioni con una struttura bipolare in cui i meristemi del germoglio e della radice si formano contemporaneamente e sono direttamente connessi tra loro a formare un’unica struttura.
gli embrioni somatici, diversamente dagli organi avventizi, sono indipendenti dai tessuti parentali, non avendo una connessione vascolare con l’espianto di partenza.
applicazione dell'organo genesi
PRODUZIONE DI METABOLITI SECONDARI
I metaboliti non prodotti da cellule indifferenziate possono essereprodotti da organi rigenerati in vitro
esempi:
Artemisia absynthium Olii volatili
Datura stramonium Scopolamina
Hyoscamus albusiosciamina enantiomero levogiro dell'atropina. Come l'atropina, è dotata di proprietà parasimpaticolitiche, inducendo tachicardia, midriasi e riduzione del tono muscolare
tecnica
hair root
(radici pelose) sono ottenute mediante
infezione con Agrobacterium rhizogenes
Aumento della Produzione di Metaboliti Secondari
Aumentare il rendimento di metaboliti secondari consente di risparmiare tempo e risorse
esempi :
Atropa belladonna Atropina
Cassia spp. Antrochinoni
Nicotiana tabacum Nicotina
espianti-->rizogenesi-->radici neoformate--> inoculo mezzo di coltura --> bireattore
La coltura in vitro di materiale vegetale finalizzata alla propagazione di una specie generalmente può avere inizio da:
Piccioli fogliari
Talee caulinari
Dischi fogliari
Meristemi caulinari (gemme vegetative apicali o gemme ascellari)
Protoplasti fogliari
La propagazione in vitro da
apici meristematici
, o mediante l’induzione di gemme vegetative nel callo, è detta
propagazione clonale,
le ‘piante’ ottenute sono cloni e possiedono caratteristiche morfologiche e metaboliche uniformi.
La coltura dei
meristemi viene anche utilizzata per risanare specie attaccate da virus, batteri e funghi, in quanto i meristemi sono sterili.
risanamento da virus:
I virus si possono trasmettere da pianta a pianta, per contatto, per seme, per polline, per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali.
Il risanamento di piante infette prevede la coltura di meristemi apicali.
Essa consiste nel prelevare un apice vegetativo ed allevarlo "in vitro“, in questo modo si otterrà l'intera pianta risanata,
l’assenza di virus deve essere confermata da saggi virologici
La coltura di meristemi può essere preceduta da
termoterapia o elettroterapia
per avere un migliore risultato nel risanamento da virus.
La termoterapia
consiste nel sottoporre la pianta, o l’espianto, ad una temperatura di 35-38 °C per tempi lunghi, alcune settimane, oppure a temperature più alte per tempi brevi.
L’elettroterapia
prevede il trattamento della pianta con brevi scosse elettriche
PROPAGAZIONE CLONALE
-
moltiplicazione dei germogli
-
germoglio--> trattamento con citochine --> ottengo tanti germogli li separo e li faccio radicare --> ottengo platula --> messa a dimora
-
rigenerazione da callo o da protoplasti
-
callo o protoplasti -->caulogenesi(citochinine)--> germogli--> biogenesi (+auxine)--> ottengo platula
può essere messa a dimora se il sistema vascolare delle radici è connesso con quello del germoglio.
-
embriogenesi somatica
- L'embriogenesi somatica è un processo biologico mediante il quale le cellule vegetali adulte (cellule somatiche), tipicamente prelevate da tessuti vegetali maturi come foglie, steli o radici, vengono indotte a svilupparsi in embrioni vegetali o strutture simili agli embrioni.
callo--> embrione somatico --> platula --> pianta
vantaggi
: tantissime piante in spazi e tempo limitato basso costo, propagazione di carattere d'interesse
svantaggi :
piante geneticamente tutte uguali
propagazione da dischi fogliari
:
1) excisione di dischi fogliari di circa 2 cm
2) Coltura su mezzo caulogenico
3) Dopo la formazione di germogli i rigeneranti si trasferiscono su terreno di radicazione
4) i germoglio radicati si sottopongono ad
ambientamento
e poi si mettono in terra
Espianti fogliari, coltivati in vitro sono in grado di formare gemme vegetative.
-propagazione a partire da protoplasti-
1) si sterilizza la superficie di una foglia e si separano pochi stati superficiali dell'epidermide e mesofillo
2) si trattano gli stati con una soluzione
contenente cellulasi e pectinasi
3) filtrazione di miscela con filtro a porosità 100 µm
4) Centrifugazione e recupero dei protoplasti
5) coltura protoplasti
6) coltura callo
7) rigenerazione
i protoplasti in coltura si. possono propagarsi per numerose generazione
e ii protoplasti del mesofillo cellulare vanno mess in coltura
con manipolo per evitare la lisi
VARIAZIONI SOMACLONALI
Dopo un
certo numero di subcolture
, o per effetto della presenza di ormoni, nelle
cellule coltivate in vitro possono insorgere variazioni morfologiche
, che si possono manifestare con diversa colorazione delle cellule, con un diverso tasso di crescita cellulare o con differente capacità rigenerative .
Queste modificazioni sono il risultato di variazioni genetiche legate alla coltura cellulare.
fattori determinanti
ORMONI
in particolare tipo e cpnecntrazione di auxine attenzione all
acido2,4-diclorofenossiacetico
numero di
subcolture
GENOTIPO
alcune varietà di specie possono essere più o meno suscettibili ai fattori determinanti la variabilità somatclonale
per esempio alcune varietà possono avere sistemi di prevenzione delle mutazione e riparazione del DNA più efficaci rispetto a invidi della stessa specie
tipo di
ESPIANTO
diversi tipi di espianti anche dacci stesso individuo posso originare diversi gradi di variabilità somaclonale:
più giovani sono gli espianti e minore è l'incidenza della variabilità somaclonale
i tessuti matiri sono mosaici di mutanti mitotici
IL SUBSTRATO
per motivi ignoti la frequenza della variabilità somaclonale può essere diversa in coltura mantenute su mezzi colturali diversi
CONDIZIONNI COLTURALI
illuminazione T° umidità . in generale più sono stressanti le condizioni di crescita e maggiore è la probabilità d'insorgenza delle variazioni somaclonali (principalmente epigenetiche)
vantaggi:
si possono trovare somacloi iperproducenti composti d'interesse
selezione di somacloni residenti a composti chimici(alluminio NaCl) ma anche metalli pesanti e matalloidi
resistenti a stress bioticie abiotici (siccità, funghi insetti)
VALUTAZIONE:
il grado di variazione soamclonale viene valutato sulla base di diversi parametri:
fenotipici
altezza pianta resistenza a stress:
selezione visiva
biochimici (
formatone di proteine M.S-):
analisi chimiche
genetici
(analisi cariotipo) marcatori molecolare grado di mediazione del DNA:
analisi citogenetiche e biomolecolari
Si definisce variazione somaclonale quel cambiamento fenotipico dovuto a modificazioni genetiche o epigenetiche che insorgono durante la coltura in vitro in piante rigenerate a partire da espianti provenienti da una pianta madre (somaclone).
Le mutazioni possono essere trasmesse alle piante rigenerate. La variazione somaclonale può avere un’origine
genetica o epigenetica.
genetiche permanenti irreversibili ed ereditabili
puntiformi
: sostituzioni nucleiche SNP
mutazioni cromosomiche
: selezioni inversioni duplicazioni traslazione
modificazioni genomiche:
-
poliploidia
variazione numerica dell'intero assetto cromosomico della cellula
aneuploida
variazione numerica di uno o pochi cromosomi
mutazioni epigenetiche
instabili e non ereditabili
metilazione del DNA:
Il processo consiste nel legame di un gruppo metile ad una base azotata. Viene utilizzata dalle cellule per il riconoscimento di DNA esogeno o alterato e per inattivarlo.
fecondazione in vitro
La fecondazione in vitro (FIV) vegetale è una tecnica sperimentale che consente la fecondazione di gameti vegetali (polline e ovuli) al di fuori dell'ambiente naturale di una pianta.
Preparazione dei Gameti: Inizia con la raccolta e la preparazione dei gameti vegetali, ovvero il polline maschile e l'ovulo femminile.
I nuclei spermatici vengono isolati dai granuli di polline o dai tubetti pollinici mediante shock osmotico o schiacciamento I gameti femminili devono essere separati dal sacco embrionale tramite mezzi meccanici o utilizzando miscele di enzimi che degradano la parete cellulare
Nel contesto della FIV vegetale, l'impollinazione avviene in vitro. Il polline viene applicato direttamente sugli ovuli coltivati in vitro. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando strumenti specializzati Induzione della fusione di due gameti mediante elettrofusione con agenti chimici si induce la fusione.
Tra gli agenti chimici sono importanti il Calcio e il polietilenglicole.
Dopo l'impollinazione, gli ovuli fecondati iniziano a svilupparsi in embrioni vegetali. Questi embrioni possono essere coltivati in vitro fino a quando diventano piante mature.
Fino ad ora, la fecondazione in vitro con sviluppo di embrione e ottenimento di pianta è stata ottenuta in mais e riso