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Différents types de microscopes photoniques - Coggle Diagram
Différents types de microscopes photoniques
luminescence
= phéno par lq e- portés à 1 état excité retournent à état fondamental en restituant 1 partie E sous forme d'émission de lum
phosphorescence
excitat° et émiss° lum découplées
T > 10^-8 s : jusqu"à qq heures
ex : luminol
fluorescence
arrêt instantanée émiss° à arrêt excitat°
T < 10^-8 sec
ex : GFP
applicat°
localisat° et colocalisat°
quantificat°
dynamique de déplacemt
photoluminescence
si E provient d'1 onde lum
chimiluniescence
E provient réact° chim
oxydat° du luminol
technique Western blot (Ac-Ag)
1er Ac fixé à Ag : 2ème Ac associé à sub lum fixé sur 1er Ac
peroxydase utilisé
donne un substrat : ici luminol
bioluminescence
luciférase catalyse réact° en oxydant luciférine en oxyluciférine en présenr O, ATP et Mg 2+
émiss° d'1 photon dt lum résultante : jaune-vert
ATP hydrolysée en AMP
luciférase = gène rapporteur
ds luciole ou Cnidaire
fluorochromes
sub chim ou bio émettant lgr onde observable en fluorescence
sub chim définie par différentes propriétées dt
spectre excitat°
spectre émiss°
lum émise + imp que lum absorbée
déplacemt de Stokes : émiss° d'1 E + basse qu'excitat° due à relaxat° état excité
lambda exc affecte pas spectre émiss° ms only intensité émiss° fluorescence
intensité de l'émiss° = amplitude spectre adsorpt°
lum excitat° + faible que lgr onde = perte E
plus lambda élevée - E : inversemt proportionnel
courbe excitat° caractéristique à chq mol où pic émiss° et excitat°
ex :
bioCr : DAPI à place BET
reconnaissance spé
fluorochromes naturels
chlorophylle (ds protoplaste)
fluorchromes synthétiques
sert à marquer autres mol
propriétés
intensité de lum émiss°
émiss° = perte E avc photons
rendement quantité (phi) = nbr tot photons émis (If)/nbr tot photons absorbés (Ia)
perte émiss° au cours tps : Fading du FITC
= diminut° jusqu'à extinct° fluorescence
bleaching = décomposit° irréversibles fluorochromes en présence O et lum
quenching = diminut° fluorescence par agts oxydants en présence sels de métaux lourds ou autres composés accepteurs E
limiter fading : utiliser fluorochrimes + performants
avantage fluorochromes Alexa
prot fluorescentes
GFP (méduse Aequorea victoria)
dépend photo-prot AEQUORIN )
en présence Ca et O : émet ds lum bleu
Aequorine active = chromophore excité
en complexe : excite GFP par transfert E non radiatif
émet fluorescence vert
hv (508 nm)
chromophore se forme ap cyclisat° et oxydat° de 3 AA d'hélice alpha : 65-66-67 (Ser/Tyr/Gly
= chromophore (portant couleur)
= fluorophore (porte fluorophore)
retour à état origine émiss° lum
ptt prot : 238 AA
extrémité C-ter et N-ter accessibles
fus° Nter ou Cter avc autres prot
param biochim
agt chaotropique = mol détruisant struct spatiale macromol bio et les dénature
pic
excitat° : 400 nm
mineur : 475 nm
variants
brillance bcp + imp
autres prot fluorescentes ex : Discosoma sp (red)
Microscopoe par épi-illuminat°
a.fluorescence conventionnel
lampe
bloc filtre : imp
1er filtre : sélect° lamda intérêt = filtre d'excitat°
miroir dichroïque : séparer lamda émiss° et lamda excitat°
réfléchit lamda excitat°
transmet lamda émiss°
filtre d'arrêt (émiss°)
de nat différentes : spectre
short pass (passe bas)
que pr excitat°
SP500 : lambda < 500
long pass (passe ht)
LP500 : lamda > 500
band pass (passe bande) : le + souvent
laisse passer lambda comprise entre 2 valeurs et bloque autres
500 +/-(30/2) : 485 à 515 nm
combinaison filtres adaptée à GFP
2 pics exictat°
1 pic émiss°
filtre multi-bandes
dble et triples bandes pr regarder pls fluorochromes simultanémt
peut générer pont phalloïdine
mitotracker : colocalisat°
échantillon fluorescent
champ éclairemt : champ large
microscope photonique
tissu vivant et mort
coupé fin et coloré
non réfringent = produit pas réfract°
fluorescent
immunomarqué
b. microscopie confocale
élimine fluorescence parasite
1 plan uniquemt focal img observée
champ élcairemt : champ ponctuel (centré sur échantillon)
lum = laser
au max 3 lasers, balayant 1 ap autres
correspondance raies laser et spectres excitat° et émissions variants GFP
épais (3D)