Commt obtenir 1 img fine + résolue ?
1.Eclairage
particules (photons) à propagat° ondulatoire
E = h * v
a.trajet optique en microscopie à trans-illuminat°
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diaphragme d'ouverture
condenseur
diaphragme de champ
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1er img de source ds plan focal condensateur
2ème img de source ds plan focal arrière de l'objectif
3ème img de source ds cristallin
ray éclairage
chq pt de source éclaire esb préparat°
ray format° img
chq pt échantillon éclairé par source conduit à 1 pt img sur rétine
b; sources de lum utilisées en trans-illuminat°
lampe à incandescence
lg durée de vie
peu émiss° ds UV
émiss° continue entre UV et IR
forte émiss° ds rge
elles chauffent
remplacées par LED
plus grde durée de vie
c. trajet optique en microscopie à épi-illuminat° -> microscopie à fluorescence
utilisat° photons
d. sources de lum utilisées en épi-illuminat°
lampe à vapeur de mercure en microscopie à fluorescence
LED = light-emitting diode ou diode electroluminescente
diodes dispo sur syst LUMENCOR
lasers en microscopie confocale
= light amplified by stimulated emiss° of radiat°
source lum monochromatique intense
différents types
laser à gaz
ex : Argon, Krypton
laser solides
ex : cristal Ti: Saphir
laser liq
ex : laser à colorants
2.Elémts d'1 microscope
oculaires
loupes grossissant de 5 à 20 fois
syst binoculaire : ajuster dist interpupillaire pr 1 observat° simultanée avvc 2 yeux
Ramsden
lzme étalonnage microscope ou micromètre
tourelle à objectifs
différents grossissemts de 4 à 100 fois
autres inf visibles
ON : 0,25 à 1,4
= capacité objectif à récupérer lum émanant de préparat°
= n * sin alpha
paramètres
n = indice de réfract° du milieu entre front objectif et lamelle
alpla = demi angle du cône de lum récupéré par objectif
lgr tube
épaisseur lamelles : 0,17 mm
dist travail
correct° aberrat° chromatiques
lum traverse différentes lgrs ondes se déplacent à vit différentes et tombent à différents endroits sur capteurs
rg, vert et bleu convergent vers différents pts
irisat°, colorat° erronée img
perte résolut° détails
lentilles montées en doublets et triplets
aberrat° géop de planéité
syst optique présente courbure de champs : img plan se focalise sur 1 port° de sphère
aberrat° induit défocalisat° partielle = zone floue ds img
platine
poser échantllon
condenseur
sert à focaliser lum sur échantillon
se règle pr correspondre à ouverture numérique de objectif utilisé
source de lum
3.optimisat° éclairemt par diaphragmes
objectif
condenseur
diaphragme d'ouverture
optimiser netteté de l'img
résolut° optimale ; 70-90 % ouverture
plus ON condenseur grde, + cône lum large
valeur max ON condenseur : 1,4
ON = cône éclairemt
doit occuper esb lentille de l'objectif
bonne img : ON cond = ON obj
réglage en fonct° objectif utilisé
plus objectif grossit : + ON grd
diaphragme de champ
pr optimiser surf éclairée à taille du champ d'observat°
ouverture modifie intensité lum ms pas résolut° syst
lentille collectrice
réglage alignemt de Köhler
rendre uniforme illuminat° champs
- mise au pt échantillon puis déplacer hors du champs
- fermer à moitié diaphragme de champ
- déplacer condenseur en htr jusqu'à voir bords nets du diaphragme de champ
4.Caractéristiques lum
lgr onde l(amda) en nm = = dist séparant 2 pts onde ayant posit° identiques
lambda = (C*h)/E
lgr onde et E inversemt proportionnelles
période (T) = tps pris par 1 des phéno d'1 onde à se reproduire
amplitude (A) = htr oscillat° d'1 onde
fréq (v) = nbr périodes par sec (Hz)
v = Célérité lum/lgr onde = C/lambda
intensité = proportionnelle à A
A² pr intensité lum
E = h * v
E = énergie transportée par photons
ondes électromagnétiques
vit propagat° c = 3 * 10^8 m.s-1
vibrat° et propagat° lum
interférence d'onde
phase d'1 onde = posit° instantanée de l'onde périodique ds période
5.propriétés lum ou échantillon en microscopie
réflex° lum
angle incidence = angle réflexion
réflex° diffuse permet voir couleurs = lgrs ondes non absorbées
absorbance (I0/I° : varier en fonct° lgr onde
réfract° lum
lum ralentie qd traverse milieu transparent/vit ds vide
dépend indice réfract° milieu
modif sens propagat° qd lum passe 1 milieu transparent à autre
n = vit lum ds vide/vit lum ds mat
n1 sin i = sin 2 sin r
onde ralentie ds mat
lgr onde diminue
retard de phase induit par mat vivante
pas réfract° avc objectif à immers° huile
dispers° lum blc
pr faisceau lum polychromatique passant air à verre = décomposit° lul
ds verre : vit lum rg + grde que vit lum bleu
verre = milieu dispersif
en fonct° lgr onde : lambda augmente, n diminue
c.diffract° lum
qd onde rencontre obj pas totalemt transparent
peut considérer que chq pt obj susceptible entraîner diffus° onde = phéno diffract°
maintenir proportionnalité : augmenter R
laser
à Argon pr GFP
config sans diffract°
rg pr rg
max central correspond à lum non diffractée = ray d'ordre O
aucune lentille ne peut éliminer maxima de 1er, 2ème, 3ème ...ordre
disque d'Airy = fig de diffract° résultant de traversée d'1 trou circulaire par lum
effet diam trou plaque
thêta = écart angulaire du faisceau diffracté par fente de largeur
si dist baisse : ray baisse = - diffract°
sin thêta degré = thêta radian = lambda/d = r/L
d diminue : r augmente
qd lambda augmente, r augmente
si L diminue : r diminue
ON augmente
qd changemt objectif
diffract° appliqué à particules
2ème diffract° : vaire en fonct° taille prot
thêta faisceau diffracté + failbe pr billes gtde tailles
résolut°
img d'1 pt = tâche d'Airy
= dist permettant de séparer 2 tâches contigües
plus dist ptte , meilleure résolut°
tient compte tâche d'Airy avc étalemt plus ou moins imp central de tâche avc ray non dévié
meilleure ds grd disque d'Airy que ptt
entre max grd pic 1er pt et min 1er pic diffract° 2ème pt = baisse intensité au - 20 %
R = dist min
microscopes : formules d'Abbe
sin thêta = ON = n sin alpha
cas d'1 objectif
ray diffracté ne sera capturé que si angle diffract° inf ou égal à ON objectif
sin thêta max = ON
R = 1,22 lambda/ 2 * ON
profondeur de champ
diminue qd ON augmente
(0,61 lambda)/(ON * tan thêta)
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