Commt obtenir 1 img fine + résolue ?

1.Eclairage

particules (photons) à propagat° ondulatoire

E = h * v

a.trajet optique en microscopie à trans-illuminat°

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diaphragme d'ouverture

condenseur

diaphragme de champ

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1er img de source ds plan focal condensateur

2ème img de source ds plan focal arrière de l'objectif

3ème img de source ds cristallin

ray éclairage

chq pt de source éclaire esb préparat°

ray format° img

chq pt échantillon éclairé par source conduit à 1 pt img sur rétine

b; sources de lum utilisées en trans-illuminat°

lampe à incandescence

lg durée de vie

peu émiss° ds UV

émiss° continue entre UV et IR

forte émiss° ds rge

elles chauffent

remplacées par LED

plus grde durée de vie

c. trajet optique en microscopie à épi-illuminat° -> microscopie à fluorescence

utilisat° photons

d. sources de lum utilisées en épi-illuminat°

lampe à vapeur de mercure en microscopie à fluorescence

LED = light-emitting diode ou diode electroluminescente

diodes dispo sur syst LUMENCOR

lasers en microscopie confocale

= light amplified by stimulated emiss° of radiat°

source lum monochromatique intense

différents types

laser à gaz

ex : Argon, Krypton

laser solides

ex : cristal Ti: Saphir

laser liq

ex : laser à colorants

2.Elémts d'1 microscope

oculaires

loupes grossissant de 5 à 20 fois

syst binoculaire : ajuster dist interpupillaire pr 1 observat° simultanée avvc 2 yeux

Ramsden

lzme étalonnage microscope ou micromètre

tourelle à objectifs

différents grossissemts de 4 à 100 fois

autres inf visibles

ON : 0,25 à 1,4

= capacité objectif à récupérer lum émanant de préparat°

= n * sin alpha

paramètres

n = indice de réfract° du milieu entre front objectif et lamelle

alpla = demi angle du cône de lum récupéré par objectif

lgr tube

épaisseur lamelles : 0,17 mm

dist travail

correct° aberrat° chromatiques

lum traverse différentes lgrs ondes se déplacent à vit différentes et tombent à différents endroits sur capteurs

rg, vert et bleu convergent vers différents pts

irisat°, colorat° erronée img

perte résolut° détails

lentilles montées en doublets et triplets

aberrat° géop de planéité

syst optique présente courbure de champs : img plan se focalise sur 1 port° de sphère

aberrat° induit défocalisat° partielle = zone floue ds img

platine

poser échantllon

condenseur

sert à focaliser lum sur échantillon

se règle pr correspondre à ouverture numérique de objectif utilisé

source de lum

3.optimisat° éclairemt par diaphragmes

objectif

condenseur

diaphragme d'ouverture

optimiser netteté de l'img

résolut° optimale ; 70-90 % ouverture

plus ON condenseur grde, + cône lum large

valeur max ON condenseur : 1,4

ON = cône éclairemt

doit occuper esb lentille de l'objectif

bonne img : ON cond = ON obj

réglage en fonct° objectif utilisé

plus objectif grossit : + ON grd

diaphragme de champ

pr optimiser surf éclairée à taille du champ d'observat°

ouverture modifie intensité lum ms pas résolut° syst

lentille collectrice

réglage alignemt de Köhler

rendre uniforme illuminat° champs

  1. mise au pt échantillon puis déplacer hors du champs
  1. fermer à moitié diaphragme de champ
  1. déplacer condenseur en htr jusqu'à voir bords nets du diaphragme de champ

4.Caractéristiques lum

lgr onde l(amda) en nm = = dist séparant 2 pts onde ayant posit° identiques

lambda = (C*h)/E

lgr onde et E inversemt proportionnelles

période (T) = tps pris par 1 des phéno d'1 onde à se reproduire

amplitude (A) = htr oscillat° d'1 onde

fréq (v) = nbr périodes par sec (Hz)

v = Célérité lum/lgr onde = C/lambda

intensité = proportionnelle à A

A² pr intensité lum

E = h * v

E = énergie transportée par photons

ondes électromagnétiques

vit propagat° c = 3 * 10^8 m.s-1

vibrat° et propagat° lum

interférence d'onde

phase d'1 onde = posit° instantanée de l'onde périodique ds période

5.propriétés lum ou échantillon en microscopie

réflex° lum

angle incidence = angle réflexion

réflex° diffuse permet voir couleurs = lgrs ondes non absorbées

absorbance (I0/I° : varier en fonct° lgr onde

réfract° lum

lum ralentie qd traverse milieu transparent/vit ds vide

dépend indice réfract° milieu

modif sens propagat° qd lum passe 1 milieu transparent à autre

n = vit lum ds vide/vit lum ds mat

n1 sin i = sin 2 sin r

onde ralentie ds mat

lgr onde diminue

retard de phase induit par mat vivante

pas réfract° avc objectif à immers° huile

dispers° lum blc

pr faisceau lum polychromatique passant air à verre = décomposit° lul

ds verre : vit lum rg + grde que vit lum bleu

verre = milieu dispersif

en fonct° lgr onde : lambda augmente, n diminue

c.diffract° lum

qd onde rencontre obj pas totalemt transparent

peut considérer que chq pt obj susceptible entraîner diffus° onde = phéno diffract°

maintenir proportionnalité : augmenter R

laser

à Argon pr GFP

config sans diffract°

rg pr rg

max central correspond à lum non diffractée = ray d'ordre O

aucune lentille ne peut éliminer maxima de 1er, 2ème, 3ème ...ordre

disque d'Airy = fig de diffract° résultant de traversée d'1 trou circulaire par lum

effet diam trou plaque

thêta = écart angulaire du faisceau diffracté par fente de largeur

si dist baisse : ray baisse = - diffract°

sin thêta degré = thêta radian = lambda/d = r/L

d diminue : r augmente

qd lambda augmente, r augmente

si L diminue : r diminue

ON augmente

qd changemt objectif

diffract° appliqué à particules

2ème diffract° : vaire en fonct° taille prot

thêta faisceau diffracté + failbe pr billes gtde tailles

résolut°

img d'1 pt = tâche d'Airy

= dist permettant de séparer 2 tâches contigües

plus dist ptte , meilleure résolut°

tient compte tâche d'Airy avc étalemt plus ou moins imp central de tâche avc ray non dévié

meilleure ds grd disque d'Airy que ptt

entre max grd pic 1er pt et min 1er pic diffract° 2ème pt = baisse intensité au - 20 %

R = dist min

microscopes : formules d'Abbe

sin thêta = ON = n sin alpha

cas d'1 objectif

ray diffracté ne sera capturé que si angle diffract° inf ou égal à ON objectif

sin thêta max = ON

R = 1,22 lambda/ 2 * ON

profondeur de champ

diminue qd ON augmente

(0,61 lambda)/(ON * tan thêta)

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