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PRACTICA 7: AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS USANDO SU PUNTOISOELÉCTRICO.
Material
◄Muestras de proteínas: Selecciona las ◄muestras de proteínas que deseas aislar y analizar.
◄Tubos de ensayo o microcentrífugas.
◄Centrífuga.
◄Pipetas de diferentes volúmenes.
◄Soporte para tubos de ensayo o racks.
◄Espátula o microespátula.
◄Pipetas serológicas.
◄Microcentrífugas o centrífugas refrigeradas.
◄Agitador magnético o placa calefactora.
◄pHímetro o papel pH
Reactivos
◄Solución salina: Para la preparación de una solución salina, puedes utilizar cloruro de sodio (NaCl) y agua destilada o tampón fosfato salino (PBS).
◄Solución tampón: Para ajustar el pH de tus soluciones, necesitarás soluciones tampón apropiadas, como tampón fosfato salino (PBS), tampón tris o cualquier otro tampón que sea adecuado para tu proteína de interés.
Solución de precipitación: Puedes utilizar solventes orgánicos como acetona o etanol para precipitar proteínas en su punto isoeléctrico.
◄Agua destilada o deionizada.Colorantes o indicadores de pH.
◄Tampón de electroforesis (para análisis de gel).
Aislamiento de Caseína:
Preparación de la Leche Descremada:
Toma 100 mL de leche descremada y colócala en un vaso de precipitados de 250 mL.
Usa un agitador magnético para agitar suavemente en la parrilla
Calibración del Potenciómetro:
Ajusta el potenciómetro con las soluciones patrón de pH 7 y pH 4.
Introduce el electrodo en el vaso con leche, cuidando de no golpearlo con el agitador magnético.
Ajuste del pH:
Agrega lentamente la solución de HCl al 20% con una pipeta Pasteur hasta que el pH alcance 4.6.
En el punto isoeléctrico, se formará un precipitado voluminoso. Detén la agitación y deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugación:
Mezcla la suspensión durante unos minutos.
Distribuye la suspensión en tubos de centrífuga, asegurándote de recuperar todo el precipitado.
Equilibra los tubos por parejas y centrifuga a 2000 rpm durante diez minutos.
Vierte el sobrenadante en una probeta y anota el volumen total.
Lavado del Precipitado:
Coloca el precipitado de todos los tubos en un vaso.
Agrega 20 mL de agua y agita para obtener una suspensión homogénea y eliminar el HCl.
Coloca la suspensión en un solo tubo de centrífuga y repite el proceso de centrifugación para eliminar el agua, repitiendo el lavado con agua dos veces más
Lavado con Etanol y Acetona:
Al eliminar el agua del último lavado, agrega 10 mL de etanol al precipitado y homogeneiza.
Vuelve a centrifugar para eliminar el etanol.
Finalmente, lava con acetona y éter etílico de la misma forma que se hizo con el alcohol.
Secado:
Recupera el precipitado y colócalo en papel aluminio en forma extendida para que se seque y forme un polvo.
Aislamiento de Albúmina:
Preparación de Albúmina:
Coloca la clara de huevo en una probeta y mide su volumen, evitando que se rompa la yema.
Vierte la clara en un vaso de precipitados y agrega una décima parte de su volumen de ácido acético 1.0 M.
Agita la mezcla
Filtración:
Filtra la albúmina acidificada a través de cuatro capas de gasa, agitando con una varilla de vidrio para acelerar el proceso.
Precipitación de Albúmina:
Agrega un volumen igual de solución de sulfato de amonio amortiguado al filtrado y agita. Deja reposar durante 15 minutos en un baño de hielo.
Centrifugación:
Separa el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos.
Precipitación de Albúmina:
Añade pequeñas cantidades de la disolución de sulfato de amonio al sobrenadante hasta que la turbidez ya no desaparezca, y agita para permitir que la albúmina precipite.
Reposo y Eliminación del Sobrenadante:
Deja la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas.
Elimina el sobrenadante por centrifugación.
Lavado y Secado:
Suspende la albúmina en 5 mL de acetona y recupera filtrando en un embudo Buchner.
Coloca el residuo en papel aluminio y deja que se seque completamente al aire.
Guarda en un vial etiquetado.
La caseína no solo se utiliza en la fabricación de quesos y productos lácteos, sino que también se ha utilizado históricamente en la producción de pintura. La caseína se mezcla con pigmentos para crear pintura al temple, que ha sido utilizada por artistas a lo largo de la historia. Esta pintura es conocida por su durabilidad y resistencia al agrietamiento, lo que la hace especialmente adecuada para la creación de obras de arte que perduran a lo largo del tiempo. Por lo tanto, la caseína ha desempeñado un papel importante tanto en la industria alimentaria como en el mundo del arte.
IMG 1 Centrifuga
IMG 2 Solución Salina
IMG 3 Albumina
IMG 4 Caseina
IMG 5 Pintura de caseina
