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TECNICHE PER LA MICROSCOPIA ELETTRONICA - Coggle Diagram
TECNICHE PER LA MICROSCOPIA ELETTRONICA
PROCEDIMENTO:
INCLUSIONE
:
IL CAMPIONE VIENE INCLUSO IN PLASTICA (RESINE EPOSSIDICHE);
FISSAZIONE
:
È ESEGUITA A FREDDO CON FISSATIVI CHIMICI NON COAGULANTI (ES. PARAFORMALDEIDE, GLUTERALDEIDE)
A CUI SEGUE LA POST-FISSAZIONE IN TRETOSSIDO DI OSMIO;
SEZIONI
:
SI USA L’ULTRAMICROTOMO CON CUI SI POSSONO OTTENERE SEZIONI ULTRAFINI (80-100 NM);
LE TECNICHE DI MICROSCOPIA ELETTRONICA POSSONO ESSERE CONSIDERATE “PROBLEMATICHE”
PERCHE' IL FASCIO DI ELETTRONI GENERATO PUÒ ATTRAVERSARE SOLO MATERIALE DI SPESSORE MOLTO RIDOTTO;
PRELIEVO
:
LE DIMENSIONI DEL CAMPIONE SONO DELL’ORDINE DI 1-2 MM3.
PRELIEVO VA EFFETTUATO A FREDDO IN SPECIFICI TAMPONI;
COLORAZIONE
:
SI USANO SALI DI METALLI PESANTI OPACHI AGLI ELETTRONI, AD ESEMPIO PIOMBO, URANIO O ORO
TUTTAVIA SONO NECESSARIE ALCUNE MODIFICHE:
L’ALLESTIMENTO DEI PREPARATI BIOLOGICI IN MICROSCOPIA ELETTRONICA SEGUE GLI STESSI CRITERI DELLA MICROSCOPIA OTTICA,
SOPRATUTTO X QUANTO RIGUARDA LA
“TECNICA DELLE FETTE“
.
LA MAGGIOR PARTE DEI TESSUTI BIOLOGICI SONO MOLLI E, DI CONSEGUENZA,
PRIMA DEL TAGLIO DEVONO ESSERE INDURITI X
FISSAZIONE
,
INCLUSIONE
O
CONGELAMENTO
;
I TESSUTI SONO NORMALMENTE QUASI INCOLORE E PRIVI DI CONTRASTO
MONTAGGIO E COLORAZIONE:
TECNICA DELL’OMBREGGIATURA
:
LO SPESSORE DEL METALLO, PERCIÒ, È + O MENO SOTTILE NELLE DIVERSE ZONE
E IL RISULTATO FINALE È UN’IMMAGINE CON AREE + SCURE CHE APPAIONO COME OMBRE
E AIUTANO A PERCEPIRE LO SPESSORE DEI DIVERSI OGGETTI.
SI PROCEDE RICOPRENDO IL PREPARATO CON UN SOTTILE STRATO DI METALLO VAPORIZZATO, COME IL PLATINO,
CHE VIENE SPRUZZATO DA UN ANGOLO OBLIQUO E SI DEPOSITA IN RAGIONE DELLA CONFORMAZIONE IRREGOLARE DELLA SUPERFICIE.
PER OTTENERE EFFETTI TRIDIMENSIONALI È NECESSARIO UTILIZZARE LA TECNICA DELL’
OMBREGGIATURA
.
LA VERA TRIDIMENSIONALITÀ SI OTTIENE SOLO CON L’UTILIZZO DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE.
IN QUESTO CASO IL PREPARATO VIENE RICOPERTO CON UN VELO DI METALLO,
POI UN SOTTILE FASCIO DI ELETTRONI SCANSIONA TUTTA LA SUPERFICIE COSÌ CHE UN RILEVATORE MISURI L’INTENSITÀ DEGLI ELETTRONI SECONDARI EMESSI DAL CAMPIONE
A SEGUITO DELLA SOLLECITAZIONE.
IL POTERE RISOLUTIVO È MINORE RISPETTO A QUELLO DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE
MA LE IMMAGINI OTTENUTE ELABORANDO IL SEGNALE CON UN COMPUTER (CON LA POSSIBILE AGGIUNTA DI FALSI COLORI)
PRESENTANO LUCI E OMBRE CHE DANNO UN’IDEA MOLTO VEROSIMILE DELLE SUPERFICI CELLULARI.
IL CRIODECAPAGGIO, O FREEZE ETCHING
QUANDO L’OGGETTO CONGELATO È COLPITO DA UNA LAMA, ANCH’ESSA CONGELATA,
AVVIENE UNA FRATTURA SU PIANI PREFERENZIALI, DI SOLITO DOVUTI A REGIONI DI LEGAMI PARTICOLARI.
AD ESEMPIO, SI POSSONO EVIDENZIARE LE PROTEINE TRANSMEMBRANA
POICHÉ IL PIANO DI FRATTURA PASSA NORMALMENTE ATTRAVERSO IL DOPPIO STRATO LIPIDICO CHE COSTITUISCE LA MEMBRANA CELLULARE.
LA TECNICA DEL CRIODECAPAGGIO NON È IMMUNE DALLA POSSIBILITÀ DI ARTEFATTI,
IN QUANTO SI POSSONO OTTENERE DISTORSIONI DELLE STRUTTURE COME CONSEGUENZA DELLA FORMAZIONE DI CRISTALLI DI GHIACCIO DURANTE IL CONGELAMENTO.
QUESTA TECNICA DI LABORATORIO SI BASA SULLA POSSIBILITÀ DI OTTENERE REPLICHE FEDELI DELLE SUPERFICI DI MATERIALI BIOLOGICI (CELLULE O TESSUTI),
DOPO AVERLI CONGELATI SOTTOVUOTO A BASSISSIME TEMPERATURE (IMMERSIONE IN AZOTO O ELIO LIQUIDO),
E OFFRE L’OPPORTUNITÀ DI EVITARE METODI + INVASIVI QUALI L’USO DI FISSATIVI CHIMICI, DISIDRATANTI O MATERIALI PER INCLUSIONE.
È 1 DELLE TECNICHE CHE PUÒ ESSERE USATA X ANALIZZARE LA STRUTTURA MACROMOLECOLARE DELLE MEMBRANE BIOLOGICHE.
COLORAZIONE NEGATIVA
:
IL CAMPIONE RIMANE INCOLORE
MA È BLOCCATO IN UN FILM DI SALE DEL METALLO PESANTE CHE È STATO OPPORTUNAMENTE ESSICCATO.
IL CAMPIONE APPARE CHIARO SU SFONDO SCURO
(APPLICATA SOPRATTUTTO X LO STUDIO DI VIRUS E MACROMOLECOLE)
COLORAZIONE POSITIVA
:
IL CAMPIONE VIENE COLORATO CHIMICAMENTE CON UNA SOLUZIONE DI SALI PESANTI
E APPARE SCURO SU SFONDO CHIARO;