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TECNICHE MOLECOLARI E APPLICAZIONI IN PATOLOGIA CLINICA 2: PCR
COS’É?
È UNA TECNICA DI BIOLOGIA MOLECOLARE X REPLICARE RIPETUTAMENTE (AMPLIFICARE), IN MODO ESTREMAMENTE SELETTIVO,
UN TRATTO DEFINITO DI DNA DEL QUALE SI CONOSCANO LE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE INIZIALI E TERMINALI,
PARTENDO DA UNA SOLUZIONE DI DNA (NUCLEARE, ORGANELLARE, PLASMIDICO, VIRALE ECC) IN CUI QUESTO TRATTO DI DNA È PRESENTE IN SINGOLA COPIA O IN UN NUMERO ESIGUO DI COPIE.
LA REAZIONE È CATALIZZATA DALL’ENZIMA DNA POLIMERASI CHE, IN VIVO, È RESPONSABILE DELLA REPLICAZIONE DEL DNA
CHE AVVIENE DURANTE LA MITOSI
LA PCR RIPRODUCE IN VITRO LA SINTESI DI UN SEGMENTO DI DNA “COMPLETO” (A DOPPIA ELICA) A PARTIRE DA UN FILAMENTO A SINGOLA ELICA.
IL FILAMENTO MANCANTE VIENE RICOSTRUITO GRAZIE A UNA SERIE DI NUCLEOTIDI
CHE VENGONO DISPOSTI NELLA CORRETTA SEQUENZA, COMPLEMENTARE A QUELLA DEL DNA INTERESSATO.
I CICLI VENGONO RIPETUTI PER 25-35 VOLTE CONSECUTIVE E SONO FORMATI DA 3 PASSAGGI SUCCESSIVI:
DENATURAZIONE DEL DNA, APPAIAMENTO DEGLI OLIGONUCLEOTIDI, POLIMERIZZAZIONE (MONTAGGIO DEI NUCLEOTIDI DA PARTE DELLA DNA POLIMERASI)
PROCEDURA
X INIZIARE LA REAZIONE OCCORRE CHE IL DNA STAMPO VENGA DENATURATO,
CIOÈ LE 2 SINGOLE ELICHE CHE COSTITUISCONO IL DNA DEVONO ESSERE COMPLETAMENTE SEPARATE
X FARE QUESTO SI PORTA LA SOLUZIONE DI DNA A UNA TEMPERATURA COMPRESA TRA 94° E 99°
SUCCESSIVAMENTE LA TEMPERATURA VIENE ABBASSATA FINO A 50-60 °C CIRCA X PERMETTERE IL LEGAME DEI PRIMER ALLE REGIONI LORO COMPLEMENTARI DEI FILAMENTI DI DNA DENATURATI (FASE DI APPAIAMENTO O DI ANNEALING).
LA DNA POLIMERASI X POTER FUNZIONARE HA BISOGNO DI UN INNESCO,
OVVERO DI UNA REGIONE A DOPPIO FILAMENTO SEGUITA DA UNA REGIONE A SINGOLO FILAMENTO
L’ENZIMA, A PARTIRE DALL’INNESCO, INCORPORA UN NUCLEOTIDE DOPO L’ALTRO,
SECONDO LA COMPLEMENTARIETÀ DELLE BASI DELL’ELICA A SINGOLO FILAMENTO (CHE FA DA STAMPO),
MUOVENDOSI IN DIREZIONE 5’ > 3’
NELLA PCR X FORMARE QUESTO INNESCO SI UTILIZZA UN BREVE FRAMMENTO DI DNA A SINGOLA ELICA (OLIGONUCLEOTIDE O PRIMER) LUNGO 15-30 bp,
IN GRADO DI APPAIARSI IN UNA SPECIFICA REGIONE DI 1 DELLE 2 ELICHE DEL DNA, SECONDO LA COMPLEMENTARIETÀ DELLE BASI.
IN UNA STESSA REGIONE DI PCR, SI UTILIZZANO 2 OLIGONUCLEOTIDI DIFFERENTI
LA REGIONE DI DNA CHE VIENE AMPLIFICATA È QUELLA COMPRESA TRA I 2 OLIGONUCLEOTIDI
INFINE LA TEMPERATURA VIENE ALZATA FINO A 72 °C AL FINE DI MASSIMIZZARE L'AZIONE DELLA DNA POLIMERASI
COSA AVVIENE
DOPO IL 1° CICLO DA UNA SINGOLA MOLECOLA DI DNA SE NE ORIGINANO 2, DOPO IL 2° CICLO DA QUESTE SE NE ORIGINANO 4,
DOPO IL 3° DA QUESTE SE NE ORIGINANO 8 E COSÌ VIA, IN MODO GEOMETRICO.
POICHÉ MOLTE DNA POLIMERASI, TRA CUI ANCHE QUELLA UMANA, NON POSSONO RESISTERE ALLE TEMPERATURE NECESSARIE PER LA DENATURAZIONE
SI FA RICORSO ALLE POLIMERASI APPARTENENTI A ORGANISMI TERMOFILI CHE NON SONO INATTIVATE DALLE ALTE TEMPERATURE, AD ESEMPIO LA TAQ POLIMERASI PROVENIENTE DAL BATTERIO TERMOFILO THERMUS AQUATICUS.
ALL'INTERNO DI CIASCUNA MICROPROVETTA VENGONO INSERITI I SEGUENTI "INGREDIENTI" IN SOLUZIONE:
ACQUA PER PORTARE A VOLUME LA SOLUZIONE.
UNA DNA POLIMERASI TERMO-RESISTENTE
OPPORTUNI PRIMERS, COSTITUITI DA BREVI SEQUENZE DI DNA (OLIGONUCLEOTIDI) COMPLEMENTARI AGLI ESTREMI 3’ DEI 2 FILAMENTI DEL SEGMENTO DA RIPRODURRE
UN BUFFER CHE SERVE A MANTENERE IL PH STABILE (TAMPONE) E NECESSARIO PER COSTITUIRE L'AMBIENTE ADATTO ALLA REAZIONE
UNA QUANTITÀ OPPORTUNA DI NUCLEOTIDI LIBERI (DESOSSIRIBONUCLEOTIDI TRIFOSFATI, DNTP) PER COSTITUIRE I NUOVI FILAMENTI
ALTRI ELEMENTI DI SUPPORTO (AD ES. IONI MAGNESIO) INDISPENSABILI PER IL CORRETTO FUNZIONAMENTO DELLA DNA POLIMERASI
UNA QUANTITÀ, ANCHE MINIMA, DEL SEGMENTO DI DNA CHE SI DESIDERA RIPRODURRE;
DOPO 30 CICLI TEORICAMENTE SI POSSONO OTTENERE OLTRE UN MILIARDO DI MOLECOLE DI DNA IDENTICHE! (2^N)
UNA REAZIONE DI PCR AVVIENE ALL'INTERNO DI MICROPROVETTE DA 200 µL CHE VENGONO INSERITE ALL'INTERNO DEL TERMOCICLATORE.
L'INTERA PROCEDURA È ASSAI RAPIDA POICHÉ CIASCUN CICLO DURA SOLO POCHI MINUTI,
E PER ESSERE REALIZZATA SI UTILIZZA UN TERMOCICLATORE OVVERO UNO STRUMENTO IN GRADO DI PROGRAMMARE NEL TEMPO,
IN MODO AUTOMATICO, LA TEMPERATURA.