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WESTERN BLOTTING O IMMUNOBLOTTING - Coggle Diagram
WESTERN BLOTTING O IMMUNOBLOTTING
COS’E’?
È UNA TECNICA ANALITICA USATA IN BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE
X IDENTIFICARE UNA PROTEINA SPECIFICA IN UNA MISCELA COMPLESSA DI PROTEINE (AD ESEMPIO UN LISATO CELLULARE)
LA TECNICA UTILIZZA 3 FASI X OTTENERE QUESTO RISULTATO:
TRASFERIMENTO SU UN SUPPORTO SOLIDO
VISUALIZZAZIONE DELLE PROTEINE CON L’USO DI APPROPRIATI ANTICORPI PRIMARI O SECONDARI
SEPARAZIONE X DIMENSIONI
LA MISCELA DI PROTEINE SOTTOPOSTA AD ELETTROFORESI SU GEL SU UNA MATRICE DI SUPPORTO (SDS-PAGE, NATIVE PAGE, FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA, ELETTROFORESI SU GEL 2D, ECC)
E SEPARATE IN BASE ALLE DIMENSIONI, ALLA CARICA E ALLA LORO STRUTTURA
LE BANDE PROTEICHE CHE SONO STATE SEPARATE VENGONO POI TRASFERITE SU UNA MEMBRANA DI SUPPORTO
(AD ESEMPIO NITROCELLULOSA, NYLON O PVDF).
QUESTO PROCESSO È CHIAMATO
BLOTTING
PUÒ ESSERE OTTENUTO CON VARI METODI, COME L’ELETTROBLOTTING O IL VACUUM BLOTTING.
L'ANTICORPO SECONDARIO E' CONIUGATO CON UN ENZIMA FLUORESCENTE O RADIOATTIVO
SUCCESSIVAMENTE VIENE AGGIUNTO UN SUBSTRATO SPECIFICO CHE REAGISCE CON QUESTO ENZIMA
SI CREA UNA REAZIONE CHE DA' ORIGINE AD UNA COLORAZIONE O EMISSIONE DI LUCE CHE PERMETTE LA RILEVAZIONE DELLA PROTEINA
LE PROTEINE SI LEGANO ALLA MEMBRANA ATTRAVERSO INTERAZIONI IDROFOBICHE
VENGONO AGGIUNTI GLI ANTICORPI CHE SI LEGANO ALLA PROTEINA BERSAGLIO
POI SI AGGIUNGONO GLI ANTICORPI SECONDARI CHE SI LEGANO AI PRIMARI
FORMANDO UN COMPLESSO ANTICORPO-ANTIGENE-ANTICORPO
CONFRONTANDO LO SPESSORE O L’INTENSITÀ DELLE BANDE OTTENUTE DALLA PROTEINA "FLUORESCENTE" CON QUELLE DEGLI STANDARD NOTI,
È POSSIBILE STIMARE LA QUANTITÀ DI PROTEINA PRESENTE.