Desarrollo de papas transgénicas Bt para el control efectivo de la polilla de la papa mediante el uso del gen cry1Ab regulado por el promotor GBSS
Vector de transformación de plantas
Excisión del gen cry1Ab modificado con señales de terminación pAOCS desde el vector pBI121 en los sitios Hind III-Sal I.
Subclonación del gen cry1Ab modificado en los sitios de clonación múltiple del vector binario pBINPLUS/ARS
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Clonación direccional del promotor GBSSi con el intrón de catalasa de ricino en los sitios Bam HI-Kpn I del mismo vector binario pBINPLUS/ARS
Vector binario pBINPLUS/ARS
Promotor GBSSi (933 bp) con intrón de catalasa de ricino (273 bp) en vector pCR II
Vector pBI121 modificado con gen cry1Ab y señales de terminación pAOCS
Marcador de selección de planta npt II fusionado al promotor ubiquitina y señales de terminación de ubiquitina
Fusión del marcador de selección de planta npt II al promotor ubiquitina y señales de terminación de ubiquitina en el vector binario pBINPLUS/ARS
Obtención del vector binario final llamado pBINCG1
Material vegetal
Figura 1
Edad de las plantas: 3-4 semanas
Edad de las plantas: 3-4 semanas
Crecimiento bajo condiciones controladas (25°C, 16 h de fotoperiodo, 30 mE m² s⁻¹)
Co-cultivación con Agrobacterium EHA 105
Obtención de microplantas in vitro
Protocolo de Transformación de Plantas
Incubación a 25°C durante 2 días
Cultivo de Agrobacterium EHA 105 con pBINCG1 en YEM con kanamicina
Colocación de segmentos de tallo intermodal en medio de precultivo (½ MS sin fitohormonas)
Dilución del cultivo de Agrobacterium 1:5 en YEM
Transferencia de pBINCG1 a Agrobacterium EHA 105
Cocultivación de segmentos de tallo intermodal con Agrobacterium durante 5 minutos con agitación
Eliminación del exceso de cultivo y retorno al medio de precultivo
Cocultivación en el medio de precultivo durante 2 días adicionale
Transferencia de segmentos de tallo cocultivados al medio de regeneración
Crecimiento en medio de regeneración
Recuperación de brotes transformados
Cultivo posterior en el invernadero
Selección de 18 brotes saludables e independientes enraizados en medio suplementado con kanamicina
Crecimiento de las plantas hasta la madurez bajo condiciones controladas inicialmente
Caracterización molecular de los brotes para verificar la presencia del transgén
Suplementación con ácido giberélico (3 mg/l), NAA (2 mg/l), sacarosa (20 g/l), agar (8 g/l) (Sigma), carbenicilina (100 mg/l) y sulfato de kanamicina (200 mg/l)
Enraizamiento de brotes resistentes a la kanamicina (3-4 cm) en medio de propagación con sales y vitaminas MS
Caracterización molecular
RT-PCR
Hibridación Northern
Hibridación Southern
Bioensayo con Insectos
Análisis de PCR
Aislamiento de ADN genómico total de 18 líneas transgénicas presuntas utilizando el procedimiento modificado de CTAB
Preparación de reacciones de PCR con 20 ng de ADN
PCR para amplificar el gen marcador seleccionable de planta npt II
PCR para la amplificación de las regiones del gen cry1Ab y el promotor GBSSi
Desnaturación a 94 °C durante 1 minuto
Alineación a 58 °C durante 1 minuto
Elongación a 72 °C durante 1 minuto
Repetición de ciclos durante 35 veces
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Extensión final a 72 °C durante 10 minutos
Desnaturación a 94 °C durante 1 minuto
Alineación a 58 °C durante 1 minuto
Elongación a 72 °C durante 1 minuto
Repetición de ciclos durante 35 veces
Extensión final a 72 °C durante 10 minutos
Lavado de la membrana con soluciones de 2xSSC; 0,1% (p/v) SDS y 1xSSC; 0,1% (p/v) SDS
Autorradiografía de la membrana
Hibridación de la membrana con la sonda a 68 °C durante la noche en un tampón Ultrahyb.
Preparación de una sonda de 1,9 kb del gen cry1Ab marcada con a32P dCTP utilizando el kit de marcado de ADN Ready-to-Go
Transferencia del ADN digerido a una membrana de nylon con carga positiva mediante acción capilar
Electroforesis del ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8%
Digestión del ADN con Bam HI durante la noche
Aislamiento de ADN genómico de hojas jóvenes de 10 plantas de papa transformadas cultivadas en invernadero.
Aislamiento de ARN total de los tubérculos almacenados de 10 líneas transgénicas cultivadas independientemente utilizando el kit RNeasy
tratamiento con DNasa I (1 unidad/ml)
Síntesis de cDNA de la primera hebra a 50 °C durante 30 minutos
Activación de la polimerasa de ADN HotStart Taq a 95 °C durante 15 minutos
Amplificación de las muestras a través de 40 ciclos en un termociclador
Uso de cry1Ab primers para la amplificación de los transcriptos cry1Ab en diferentes tejidos, incluyendo hojas maduras, hojas jóvenes, tallo, estolones y tubérculos.
58 °C durante 1 minuto
72 °C durante 1 minuto
94 °C durante 1 minuto
Extensión final a 72 °C durante 10 minutos
Hibridación durante la noche a 42 °C con un fragmento del gen cry1Ab marcado con a32P dCTP utilizando el kit de marcado aleatorio (Amersham) como sonda
Lavado de la membrana con 0.5x SSC, 1% SDS (baja stringencia)
Transferencia del ARN a una membrana Brightstar con carga positiva (Ambion)
Lavado final con 0.1x SSC, 1% SDS (alta stringencia)
Separación de una cantidad igual de ARN (1 mg) en un gel de formaldehído desnaturalizante
Almacenamiento de la membrana en una autorradiografía a -80 °C
Aislamiento de ARN total de los tubérculos almacenados mediante el procedimiento de fenol/cloroformo
Utilización de larvas neonatas de la polilla de los tubérculos de papa criadas in vitro
Estudios de bioensayo en hojas separadas y tubérculos almacenados
Liberación de dos larvas neonatas de 3 días de edad en líneas de papa transformadas de manera independiente
Registro de mortalidad y grado de daño en hojas y tubérculos después de 21 días
Se encontro:
Uso eficiente de esquejes de segmentos de tallo internodal de plantas del tuberculo
El medio de regeneración demostró ser eficiente para la organogénesis.
Desarrollo de un vector de transformación llamado pBINCG1 que contiene una versión modificada del gen cry1Ab bajo el control del promotor GBSSi y el terminador OCS para la transformación de la papa
Regeneración exitosa de brotes transformados a partir de los extremos cortados de los segmentos de tallo internodal después de 4 semanas
Se desarrollaron callos organogénicos en los segmentos de tallo cortados
Se encontro:
La expresión de Cry1Ab en las plantas de papa mostró una variabilidad significativa en términos de resistencia a las larvas de la polilla de los tubérculos de papa
Una línea específica de tubérculos, CG127, se destacó por no presentar daño alguno incluso después de 21 días de exposición a las larvas de PTM, y todas las larvas murieron en esta línea
Alta tasa de mortalidad de las larvas neonatas de PTM, lo que indica una eficacia en la resistencia conferida por la expresión de Cry1Ab.
Los tubérculos no transformados de control mostraron daños extensos después de 21 días de incubación con larvas de PTM
Los tubérculos transgénicos almacenados apenas sufrieron daños por parte de las larvas de PTM
La línea de tubérculos transgénicos CG127 demostró una resistencia excepcional, incluso cuando los tubérculos se almacenaron y se sometieron a una infestación de larvas de PTM durante 21 días
Se encontro:
Solo 10 de las 18 líneas positivas para npt II pudieron generar una banda positiva de 1206 pares de bases para el promotor GBSSi
En estas 10 líneas positivas GBSSi/npt II, se detectó la presencia del gen cry1Ab con una banda esperada de 700 pares de bases
Todas las 18 líneas transformadas fueron resistentes a la kanamicina y mostraron un amplicón de 713 pares de bases correspondiente al gen npt II
No se detectaron amplificaciones en las líneas de papa no transformadas para el gen cry1Ab
Dieciocho líneas transformadas mostraron un crecimiento saludable y tuberización en condiciones de invernadero
El análisis Southern reveló que tres líneas tenían un solo evento de inserción de transgen, mientras que en las siete líneas restantes se evidenciaron dos o más eventos de inserción
Se encontro:
Se observó que la expresión más alta del gen cry1Ab se encontraba en los estolones y tubérculos, seguida de las hojas viejas y las hojas jóvenes
No se detectó expresión del gen cry1Ab en el tallo
La técnica de RT-PCR utilizando cebadores cry1Ab resultó en la amplificación exitosa de fragmentos de 700 pares de bases, que corresponden al tamaño esperado, en los tubérculos de 7 de las 10 líneas transgénicas analizadas
Se encontro:
Se obtuvo una señal de hibridación positiva que correspondía a un transcripto de cry1Ab de 700 pares de bases en todos los tubérculos almacenados
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