Excisión del gen cry1Ab modificado con señales de terminación pAOCS desde el vector pBI121 en los sitios Hind III-Sal I.

Subclonación del gen cry1Ab modificado en los sitios de clonación múltiple del vector binario pBINPLUS/ARS

Clonación direccional del promotor GBSSi con el intrón de catalasa de ricino en los sitios Bam HI-Kpn I del mismo vector binario pBINPLUS/ARS

Promotor GBSSi (933 bp) con intrón de catalasa de ricino (273 bp) en vector pCR II

Vector pBI121 modificado con gen cry1Ab y señales de terminación pAOCS

Marcador de selección de planta npt II fusionado al promotor ubiquitina y señales de terminación de ubiquitina

Fusión del marcador de selección de planta npt II al promotor ubiquitina y señales de terminación de ubiquitina en el vector binario pBINPLUS/ARS

Crecimiento bajo condiciones controladas (25°C, 16 h de fotoperiodo, 30 mE m² s⁻¹)

Cultivo de Agrobacterium EHA 105 con pBINCG1 en YEM con kanamicina

Colocación de segmentos de tallo intermodal en medio de precultivo (½ MS sin fitohormonas)

Cocultivación de segmentos de tallo intermodal con Agrobacterium durante 5 minutos con agitación

Eliminación del exceso de cultivo y retorno al medio de precultivo

Cocultivación en el medio de precultivo durante 2 días adicionale

Transferencia de segmentos de tallo cocultivados al medio de regeneración

Selección de 18 brotes saludables e independientes enraizados en medio suplementado con kanamicina

Crecimiento de las plantas hasta la madurez bajo condiciones controladas inicialmente

Caracterización molecular de los brotes para verificar la presencia del transgén

Suplementación con ácido giberélico (3 mg/l), NAA (2 mg/l), sacarosa (20 g/l), agar (8 g/l) (Sigma), carbenicilina (100 mg/l) y sulfato de kanamicina (200 mg/l)

Enraizamiento de brotes resistentes a la kanamicina (3-4 cm) en medio de propagación con sales y vitaminas MS

Aislamiento de ADN genómico total de 18 líneas transgénicas presuntas utilizando el procedimiento modificado de CTAB

Lavado de la membrana con soluciones de 2xSSC; 0,1% (p/v) SDS y 1xSSC; 0,1% (p/v) SDS

Hibridación de la membrana con la sonda a 68 °C durante la noche en un tampón Ultrahyb.

Preparación de una sonda de 1,9 kb del gen cry1Ab marcada con a32P dCTP utilizando el kit de marcado de ADN Ready-to-Go

Transferencia del ADN digerido a una membrana de nylon con carga positiva mediante acción capilar

Aislamiento de ADN genómico de hojas jóvenes de 10 plantas de papa transformadas cultivadas en invernadero.

Aislamiento de ARN total de los tubérculos almacenados de 10 líneas transgénicas cultivadas independientemente utilizando el kit RNeasy

Síntesis de cDNA de la primera hebra a 50 °C durante 30 minutos

Activación de la polimerasa de ADN HotStart Taq a 95 °C durante 15 minutos

Hibridación durante la noche a 42 °C con un fragmento del gen cry1Ab marcado con a32P dCTP utilizando el kit de marcado aleatorio (Amersham) como sonda

Lavado de la membrana con 0.5x SSC, 1% SDS (baja stringencia)

Transferencia del ARN a una membrana Brightstar con carga positiva (Ambion)

Separación de una cantidad igual de ARN (1 mg) en un gel de formaldehído desnaturalizante

Almacenamiento de la membrana en una autorradiografía a -80 °C

Aislamiento de ARN total de los tubérculos almacenados mediante el procedimiento de fenol/cloroformo

Utilización de larvas neonatas de la polilla de los tubérculos de papa criadas in vitro

Estudios de bioensayo en hojas separadas y tubérculos almacenados

Liberación de dos larvas neonatas de 3 días de edad en líneas de papa transformadas de manera independiente

Registro de mortalidad y grado de daño en hojas y tubérculos después de 21 días

Uso eficiente de esquejes de segmentos de tallo internodal de plantas del tuberculo

El medio de regeneración demostró ser eficiente para la organogénesis.

Desarrollo de un vector de transformación llamado pBINCG1 que contiene una versión modificada del gen cry1Ab bajo el control del promotor GBSSi y el terminador OCS para la transformación de la papa

Regeneración exitosa de brotes transformados a partir de los extremos cortados de los segmentos de tallo internodal después de 4 semanas

Se desarrollaron callos organogénicos en los segmentos de tallo cortados

La expresión de Cry1Ab en las plantas de papa mostró una variabilidad significativa en términos de resistencia a las larvas de la polilla de los tubérculos de papa

Una línea específica de tubérculos, CG127, se destacó por no presentar daño alguno incluso después de 21 días de exposición a las larvas de PTM, y todas las larvas murieron en esta línea

Alta tasa de mortalidad de las larvas neonatas de PTM, lo que indica una eficacia en la resistencia conferida por la expresión de Cry1Ab.

Los tubérculos no transformados de control mostraron daños extensos después de 21 días de incubación con larvas de PTM

Los tubérculos transgénicos almacenados apenas sufrieron daños por parte de las larvas de PTM

La línea de tubérculos transgénicos CG127 demostró una resistencia excepcional, incluso cuando los tubérculos se almacenaron y se sometieron a una infestación de larvas de PTM durante 21 días

Solo 10 de las 18 líneas positivas para npt II pudieron generar una banda positiva de 1206 pares de bases para el promotor GBSSi

En estas 10 líneas positivas GBSSi/npt II, se detectó la presencia del gen cry1Ab con una banda esperada de 700 pares de bases

Todas las 18 líneas transformadas fueron resistentes a la kanamicina y mostraron un amplicón de 713 pares de bases correspondiente al gen npt II

No se detectaron amplificaciones en las líneas de papa no transformadas para el gen cry1Ab

Dieciocho líneas transformadas mostraron un crecimiento saludable y tuberización en condiciones de invernadero

El análisis Southern reveló que tres líneas tenían un solo evento de inserción de transgen, mientras que en las siete líneas restantes se evidenciaron dos o más eventos de inserción

Se observó que la expresión más alta del gen cry1Ab se encontraba en los estolones y tubérculos, seguida de las hojas viejas y las hojas jóvenes

La técnica de RT-PCR utilizando cebadores cry1Ab resultó en la amplificación exitosa de fragmentos de 700 pares de bases, que corresponden al tamaño esperado, en los tubérculos de 7 de las 10 líneas transgénicas analizadas

Se obtuvo una señal de hibridación positiva que correspondía a un transcripto de cry1Ab de 700 pares de bases en todos los tubérculos almacenados