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- genomica funzionale - L'analisi delezionale di Xist rivela un'…

- - - - è emerso che:
        
        la diffusione di Xist e dei complessi proteici PRC1 e PRC2 è strettamente collegata.
        
        L'eliminazione di Repeat B o della proteina HNRNPK, che interagisce direttamente con Repeat B, ha compromesso la capacità dei complessi proteici di aderire al cromosoma X inattivo.
        
        quando PRC1 o PRC2 sono stati rimossi, la diffusione di Xist è stata interrotta
    - - risultati suggeriscono che l'RNA Xist e i complessi proteici PRC1 e PRC2 lavorano insieme in modo interdipendente. Quando uno di loro manca, l'altro non può funzionare correttamente.
        Questo indica l'esistenza di un tipo di "feedback positivo" tra l'RNA Xist e le proteine PRC1 e PRC2.
      - se la diffusione di Xist e dei complessi proteici PRC1 e PRC2 viene disturbata, ciò
        causa un fallimento nell'inattivazione del cromosoma X e influisce sulla struttura del cromosoma stesso.
- - - - Sono stati creati mutanti dell' RNA XIST andando a togliere i vari motivo ripetuti
      - per selezionare le delezioni desiderate è stata utilizzata ibridazione in situ (FISH) con fluorescenza dell'RNA a due colori - sonde ciano esterne e sonde rosse interne a ciascuna delezione - e cloni selezionati che presentano ciano senza segnale rosso sovrapposto essi erano i cloni che avevano subito le delezioni desiderate.
        puoi convalidate con sanger
  - - - Repeat A:
        Questa ripetizione è già nota per il suo ruolo nel silenziamento genico. Con la cancellazione minima di Ripeat A mantiene la nuvola Xist intatta e un livello complessivo di RNA, ulteriori analisi hanno rivelato uno splicing aberrante, dove un'area di giunzione criptica è stata attivata. Questo ha portato al salto dell'esone 1 in oltre il 50% delle trascrizioni. visto l’effetto non hanno proseguito con ulteriori cloni ΔRepA.
      - Repeat F:
        L'eliminazione della regione contenente la Repeat F ha portato alla perdita o al significativo indebolimento delle nuvole Xist.
        è stata confermata tramite. qRT-PCR in ΔRepF Xi / cellule ha confermando una riduzione del livello di RNA Xist
      - Esone 2-6:
        l'eliminazione degli esoni interni da 2 a 6 ha causato una nuvola Xist più debole e una diminuzione dei livelli di RNA. Questo potrebbe influenzare l'efficienza dello splicing o la stabilità della trascrizione.
      - Repeat E:
        l'eliminazione della regione contenente la Repeat E ha causato una dispersione diffusa di Xist in tutto il nucleo.
      - Repeat B:
        l'eliminazione della regione contenente la Repeat B ha prodotto nuvole Xist con una morfologia aberrante.
        il mutante ΔRepB ha fatto apparire le nuvole Xist più diffuse pur rimanendo localizzate vicino alle vicinanze di Xi
        La nuvola Xist diffusa di ΔRepB non era dovuta a cambiamenti nel livello di RNA Xist, né al mancato reclutamento della proteina della matrice nucleare CIZ1 come nel caso di ΔRepE
        Pertanto, DRepB rappresenta un meccanismo distinto di localizzazione dell'RNA Xist.
        
        Per individuare l'elemento specifico responsabile del fenotipo di DRepB, abbiamo generato dell subdelezione da 300 bp della stessa ripetizione B (DRepBd)
    - - è stato eseguito un esperimento in cui sono state analizzate diverse delezioni all'interno del gene Xist e il loro impatto sui livelli di RNA Xist nelle cellule MEF.
        Questi livelli sono stati misurati utilizzando la tecnica qRT-PCR, che è una metodologia che consente di quantificare in modo preciso la quantità di RNA presente in un campione.
      - info in più per le immagini
        
        Error Bars (Barre di errore): Sono le linee verticali che partono dai punti rappresentativi su ciascuna barra. Rappresentano la variazione o la dispersione dei dati. In altre parole, mostrano quanto i dati dei tre replicati biologici si discostino dalla media. Più lunga è la barra di errore, maggiore è la variazione tra i replicati biologici.
        
        SD (Standard Deviation - Deviazione Standard):
        È una misura di quanto i dati siano dispersi attorno alla media. Maggiore è la deviazione standard, maggiore è la variazione nei dati
    - - i ricercatori hanno effettuato ulteriori studi per capire se le delezioni di parti specifiche di Xist avessero un impatto sulle modifiche chimiche presenti sulla cromatina del cromosoma X inattivo (Xi).
        Queste modifiche chimiche, chiamate marchi epigenetici, sono controllate da Xist e dai complessi proteici PRC1 e PRC2, e influenzano l'attività dei geni nel cromosoma.
        
        sono stati esaminati diversi mutanti di Xist, ciascuno con delezioni specifiche, utilizzando l’immunofluorescenza per visualizzare i due tipi di modifiche epigenetiche, ovvero H2AK119ub e H3K27me3.
        Da questa analisi è emerso che il mutante ΔRepA Xi mostrava una riduzione di entrambe le modifiche epigenetiche, e questo potrebbe essere dovuto alla perdita di Repeat A o ad altri parti dell’esone 1. Ridotti livelli di queste modifiche sono stati riscontrati anche in ΔRepF e ΔEx2-6, probabilmente a causa della diminuizione dei livelli di Xist.
        il mutante ΔRepE, che mostrava un effetto maggiore sulla posizione di Xist ma solo una perdita moderata dei marchi epigenetici.
        
        H2AK119ub (Ubiquitinazione di Istone H2A alla posizione 119):
        L'ubiquitinazione è un processo in cui una piccola proteina chiamata ubiquitina viene legata a una proteina bersaglio.
        Nel caso dell'istone H2A alla posizione 119, l'ubiquitinazione porta alla formazione di H2AK119ub.
        Questa modifica epigenetica è spesso associata alla repressione dell'espressione genica. Quando l'istone H2A è ubiquitinato in questa posizione, può influenzare la struttura della cromatina e rendere i geni meno accessibili alle proteine coinvolte nella trascrizione (il processo in cui l'informazione genetica viene trascritta in molecole di RNA).
        
        H3K27me3 (Metilazione di Istone H3 alla lisina 27):
        La metilazione è un'altra modifica chimica che può verificarsi sugli istoni, le proteine che costituiscono la cromatina.
        Nel caso dell'istone H3 alla lisina 27, la metilazione porta alla formazione di H3K27me3.
        Questo marchio epigenetico è associato alla repressione dell'espressione genica simile a H2AK119ub. Quando l'istone H3 è metilato in questa posizione, può contribuire a creare un ambiente che silenzia o riduce l'attività dei geni.
        
        il mutante ΔRepB ha mostrato una situazione diversa. Anche se Xist era ancora presente in parte sul cromosoma X inattivo mutante, le modifiche H2AK119ub e H3K27me3 erano completamente assenti.
        Per tale ragione, gli studi successivi si sono concentrati su ΔRepB e sul suo effetto sia sulla localizzazione di Xist che sulle mo0difiche della cromatina di Xi.
        
        slide
      - Modifiche epigenetiche:
        Le modifiche epigenetiche includono cambiamenti chimici alla struttura del DNA e alle proteine associate al DNA. In questo caso, si stavano analizzando due segni specifici: H2AK119ub e H3K27me3. Questi segni sono mediate rispettivamente da complessi proteici PRC1 e PRC2. Queste modifiche sono coinvolte nell'inattivazione del cromosoma X e contribuiscono alla sua condensazione e silenziamento.
- - - - Queste cellule erano tetraploidi,(avevano quattro copie del genoma) con due copie del cromosoma X inattivo (Xi) e due copie attive (Xa) all'interno dello stesso nucleo. Questo accade dopo che l'inattivazione del cromosoma X (XCI) è già avvenuta, quindi avevano due cromosomi X inattivi (Xi) e due cromosomi X attivi (Xa).
        Questo consente di manipolare specificamente i cromosomi X inattivi o attivi per studiare l'effetto delle delezioni all'interno del gene Xist su ciascun tipo di cromosoma.