Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
蛋白质的性质和敏感性 - Coggle Diagram
蛋白质的性质和敏感性
蛋白质检测方法
灵敏度
应该对蛋白质稀释和全过程收率有一个评估
准确性，准确性一般不是首先要求的，因为没有一个万能的检测方法
粗提组分，显色反应尤其是Bradford法最好
层析柱流出液，UV-vis方法最好，无消耗，简便，灵敏，可在线监测，但是要考虑到核酸，同时也是表征工艺可重复性的重要指标
绝对含量，需要氮含量检测法
精密性，精密性和准确性是相互协调的，需要保证重复性和合理的回收率
线性，随着开发过程推进，线性是不断地进行重新评估，尤其是活性，杂质可能会影响活性的线性，检测范围需要相应的调整
检测物料可得性：比如底物和抗原的可得性，以及标品的可得性，和检测方法实用性相关
时间和金钱成本，检测方法能否在某时间同时完成合理数量分离组分的检测
需要检测的预约制度
纯化和检测方法在整个开发周期都是不断迭代修正的过程
不推荐使用ELISA和PAGE方法进行蛋白活性的判定
检测的最佳条件总是凭经验确定的（平台检测方法），但是最佳检测条件经常会随纯化进程而改变
蛋白质的性质和敏感性
溶解性或助溶剂
高低浓度稳定性
高低盐稳定性
高低温稳定性
高低pH稳定性
氧化稳定性
冻存/融稳定性
清楚过程避免的条件
蛋白质的存储
不能冰冻：冰上保存或者或者-20摄氏度添加足够多的甘油或蔗糖，以避免冰冻
可以冰冻：使用液氮或者超低温冰箱
避免使用无霜冷藏设备，因为可能会造成小体积反复冻融，如果一定要用，使用能够严格密封的存储器皿
样品应该提前等量小体积分装，避免反复冻融造成蛋白质活性损失
溶解过程应该快速，减少部分溶解在溶液中的蛋白质与浓缩的溶质成分的接触时间（冷冻相分离）
磷酸氢二钠的溶解度对温度非常敏感，在低温条件下会首先析出，从而导致溶液的pH下降最多达3～4个单位，此时对酸敏感的蛋白质则易发生降解
存储材质：聚丙烯＞聚乙烯=聚苯乙烯＞玻璃，尤其是浓度低的时候
蛋白质溶液添加物
原则是只添加有利于蛋白质稳定的物质
不要使用商业试剂，更换为成分已知的“鸡尾酒”式缓冲液
蛋白质稳定性实验很有重要的价值
最佳储存条件可能会随着纯化过程变化
存储条件可能会改变多肽键的相互作用
AA0项目的样品在-20℃会出现单体向二聚体转变的情况
最佳的存储条件不一定要和保持蛋白质活性的最佳条件相关
一般情形
还原剂对于细菌酶类的储存十分有效
动物的酶类都能接受表面活性剂或蛋白酶抑制剂
因为动物酶类的细胞膜就是一种表面活性剂？
真菌蛋白质也能接受蛋白酶抑制剂
准备工作：了解目的
用途
质量
纯度
是否一定要正确折叠
是否结合其他物质才具有活性
制定纯化流程
选择合理的检测手段
最终的方案要适合放大到所需的量
单个纯化步骤应该是从高载量低成本到低载量高成本
需要准备多种可供选择的实验方案
毫克级别蛋白质的生产和检测（小样）
克级别的生产和检测（工艺开发和锁定）
千克级别的生产和检测（Non-GMP和GMP生产）
p53蛋白，有大量辅助多肽，多种修饰模式和聚集状态，至今没有比较好的纯化方案
蛋白质活性的污染
最终的纯化产物中一定不能出现能够影响目的产物的酶类，比如核酸酶、蛋白酶和磷酸酶类
通常在纯化最后一步或者是倒数第二步对分里最分进行选择，以优化目标蛋白质产量、降低总蛋白质含量并最佳化目标活性
应该确保纯化产物的活性来自于目标蛋白，使用一些独立的方法如沉降非变性凝胶等方法验证目标蛋白质和火星之间是相关的（通过其他方法把目的蛋白质分离下来，验证活性来自于目的蛋白质）