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蛋白质考虑因素 - Coggle Diagram
蛋白质考虑因素
过表达蛋白质
哪种表达系统？
翻译后修饰是否恰当
具有活性的聚集状态是什么以及能否获得
如果是外源表达，是否会因为内源性类似物存在而引起干扰
例如人p53在CHO细胞内的表达
是否应该使用经过改造（敲除类似物或者核酸酶、蛋白酶）的宿主细胞
异多亚基蛋白过表达
首先要知道每一个亚基的表达效率
通过优化转染水平和启动子效率控制各亚基表达，似的亚基的产量与所需的化学计量相当
纯化标签
是否会影响后续的研究工作？
应该在N-端、C-端还是中间？
如果N-端，翻译中止的杂质会污染；如果C端，功能和结合特性将会受干扰
精纯过程
一般策略：从高载到低载，偶尔尝试特殊填料
衔接步骤越紧凑越少越好，结合洗脱模式有浓缩蛋白的作用，流穿模式会略微稀释蛋白
有利保存的蔗糖和甘油却可能不利于纯化
需要优化各步骤前后顺序
前期研究（为了获得序列信息），值得考虑来源
蛋白质含量
起始活性
稳定性
制备提取物
细胞破碎方式会影响目的蛋白最终的产量和质量
放大，需要在破碎前进行分级分离操作（物理方法粗分）
细胞破碎缓冲液可能不利于蛋白质稳定性和影响后续操作
低渗、螯合剂、极端pH
裂解缓冲液中目的蛋白不溶
溶液置换是常见的操作
物理方法非常规纯化
温和：盐析和有机聚合物沉析
剧烈：对稳定性好的目的蛋白，加热，极端pH、有机溶剂萃取，可能会存在不可预见的难以检测的损伤
填料直接加入料液里或者层析柱批量纯化？
纯化载量
高载：一般是离子和亲和，如果pH该表通常可以再次应用于终末期
中载：一般是疏水
容易失活，要研究洗脱的条件和材料，保证洗脱的同时不影响亚基结构、失去稳定性和失活钝化
SEC-HPLC一般是中载
低载：使用昂贵配体的亲和层析步骤
例如AA0项目客户转移方法
电泳法也是低载，包括等电聚焦
快速稀释高盐、含甘油和蔗糖的蛋白溶液经常会导致活性损失，层析前需要过滤浑浊样品以免流速下降
沉降和HPLC方法不能有效放大，一般放在纯化终末期