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genome editing - Coggle Diagram

- - - - Nella review quello che cercano di capire principalmente è la risposta tessuto specifica della pianta alla siccità e come questo segnale viene trasferito all’interno della pianta
  - - - Un’altra risposta comune nelle piante è evitare la disidratazione→ la pianta cerca di limitare la traspirazione, chiude gli stomi e questo viene indotto dall’ABA (acido abscissico), depone cere sulla cuticola che impermeabilizza e cerca di rallentare il suo ciclo vitale.
        tutti questi fattori sono sconvenienti per l’agricoltore
      - Una caratteristica che hanno solo alcune piante, ma che hanno tutte le piante a livello del seme (mantiene solo il 10% di acqua e si mantiene vitale anche in condizioni di estrema siccità), che si disidratano ma rimangono vitali. Sono normalmente piante desertiche
      - Tutte le piante producono particolari zuccheri, particolari osmoprotettori (alcune proteine vengono prodotte in seguito alla disidratazione nelle piante e che le aiutano sopravvivere), producono antiossidanti per cercare di contrastare la produzione di ROS, perchè quando la fotosintesi smette di funzionare in seguito a disidratazione vengono prodotte specie reattive dell’ossigeno.
        Tutto questo serve da una parte per trattenere acqua dentro le cellule e da una parte per proteggersi da eventuali malfunzionamenti del metabolismo con produzione di ROS
        
        Risposta molecolare delle piante agli stress abiotici→ lo stress viene captato da recettori, il segnale viene trasdotto fino al nucleo dove modifica l’espressione genica. Questo può essere studiato a diversi livelli di proteoma, trascrittoma ecc…
        
        In particolare vediamo come agisce la siccità e cosa ha in comune con la salinità e il calore.
        Abbiamo già visto l’etilene e i brassinosteroidi, ora vediamo in particolare l’ABA
        L’ABA è l’ormone che serve per chiudere gli stomi ed è molto simile all’etilene, possiede tutta una serie di risposte collegate all’etilene che bloccano la crescita.
        Ha un segnaline caratterizzato con tutta una serie di chinasi, fosfatasi che vanno a regolare la funzione dei fattori di trascrizione che entrano nel nucleo e modificano geni a valle dei pathway ormonali.
        
        La siccità non ha solo una risposta ABA-dipendente ma ha anche una via di trasduzione separata chiamata ABA-indipendente che richiede la presenza di alcuni particolari fattori di trascrizione come per esempio DREB2A, su questo pathway agiscono anche calore e salinità.
        
        oggi vedremo altre proteine manipolate con successo quali CspA, CspB e in questo caso parliamo di OGM veri e propri, e anche Hahb4.
        
        Hahb4→ queste piante sono già sul mercato in argentina e in qualche altra nazione.
        Altro esempio di come la ricerca di base viene coniugata alla ricerca applicata.
        di questo gene Hahb4 che è un homeobox-leucine zipper (geni omeotici sono quelli che determinano lo sviluppo di un particolare organo e sono normalmente dei fattori di trascrizione che regolano l’espressione di altri geni)
        dove viene espresso, viene espresso dalla siccità.
        A questo punto una volta capito che veniva indotto dalla siccità studiano il timing: vanno a osservare come viene modulata l’espressione dopo la reidratazione e osservano che viene molto espresso e successivamente alla reidratazione i livelli calano
        poi vado a vedere dove è espresso
        
        capiscono che Hahb4 è un regolatore della crescita.
        Vanno a trasformare Arabidopsis con un costrutto che sovraesprime il gene.
        
        ’analisi del fenotipo:
        fanno un esperimento particolare ovvero vanno a reidratare le piante dopo aver indotto la siccità questo perché è così che osservi quali piante hanno resistito alla siccità, se si riprende bene allora ha funzionato.
        Si vanno a studiare ogni linea indipendente, nelle foto si osserva la differenza tra WT e trasformanti in condizioni di siccità a diversi stadi di crescita. Quello che si osserva è che la pianta transgenica sta meglio anche senza lo stress abiotico (infatti è anche un regolatore dello sviluppo).
        
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- - - - In Arabidopsis è stato isolato con microarray con obiettivo di trovare geni che rispondevano all’NAA che è un’auxina sintetica, molto stabile, anche più di quella naturale.
        Se si spruzza ad alti livelli uccide le piante; loro volevano trovare geni indotti dall’auxina.
        1) Fanno immersioni nell’NAA e vedono espressione prima e dopo, cos’ facendo trovano il gene ARGOS (A),
        2) fanno subito un Northen (B) con RNA, per vedere livelli di trascritto del gene, hanno preso piantine, messe su auxina, estratto l’RNA a tempi crescenti e hanno visto come cambiava l’espressione di ARGOS tramite sonda radioattiva ibridata su una membrana dove è stato trasferito l’RNA prima separato su gel.
        3) Il secondo (C) è un northen fatto su diversi organi della pianta; Radici. Stelo, Foglie giovani, Foglie Adulte, Fiori e Silique rispettivamente.
        4)Nell’immagine D c’è un’analisi GUS, ovvero è stato fuso il promotore di ARGO, fuso in una regione che codificava per GUS e inserito il costrutto in Arabidopsis, dove vediamo blu, il gene è stato espresso
      - Per avere la conferma, tolgo il gene o lo sovraproduco per essere sicuro
      - Un frammento di cDNA che contiene l’ORF di ARGOS è stato clonato nel vettore sia senso che antisenso;
        cioè sia dritto che al contrario, nella pianta senso si ha sovrapressione del trascritto, nelle piante antisenso, che vengono chiamate anti-ARGOS, il trascritto si appaia con ARGOS senso, e fa RNA interference non facendolo produrre.
        
        Fanno piante controllo, anti-ARGOS e sovraesprimenti
        Fanno piante controllo, anti-ARGOS e sovraesprimenti.
        Al centro c’è la pianta con il controllo, a sinistra quella anti-sensata, e a destra quella che sovraesprime; a destra si hanno le foto le foglie dei vari mutanti. Quella antisensata va a fioritura prima.
        Si vede nell’immagine sottostante, che 15 giorni dopo l’ultimo apporto di acqua i mutanti 35S continuano ad essere verdi rispetto al WT
        
        Si vede nell’immagine sottostante, che 15 giorni dopo l’ultimo apporto di acqua i mutanti 35S continuano ad essere verdi rispetto al WT
        
        L’obbiettivo è spostare il costrutto da Arabidopsis a Mais, non è scontato questo passaggio perché sono molto diverse.
        I risultati di un altro studio sono illustrati, fanno vedere la differenza tra i geni di mais (ZM) e Arabidopsis (At) e si vede che sono conservati.
        Questa tecnica è molto utilizzata per vedere geni conservati in piante diverse, sono stati portati e confrontati i gnei di mais in Arabidopsis.
        In particolare, si è verificato anche l’espressione di due mutanti, etr1 e ein2, mutati nel patway dell’etilene, che è un ormone gassoso che fa smettere di crescere la pianta in presenza di stress, inibisce la crescita in foglie giovani e non già sviluppate.
        Visto il ruolo dell’etilene si potrebbe toccare questo patway per aumentare la crescita
        
        Il patway dell’etilene comincia da una serie di stress di varia natura che agiscono sul prodotto ultimato.
        All’inizio l’etilene viene sintetizzato come ACC (non gassoso, versione trasportabile), il precursore, derivato da metionina e SAM.
        Viene trasportato nelle cellule target ed emesso sotto forma di etilene (C2H4) dalla pianta, verso altre piante.
        Dei recettori dell’etilene sono presenti nella pianta che innescano una serie di map chinasi che vanno fosforilare i fattori di trascrizione che agiscono sul DNA.
        Argos si trova all’inizio della catetena di segnalazione dell’etilene, in particolare è il repressore della linea del signaling dell’etilene
        
        vedendo i segnali ambientali posso regolare la biosintesi dell'etilene e posso indurre fattori repressi dall'etilene
        
        prendo
        ARGOS8 e si sovraesprime in Mais vediamo come si comportano le piante in Alto e basso stress di siccità:
        Hanno preso 8 individui transgenici, la media di tutte le linee sopra e il Null (controllo).
        Hanno fatto esperimenti di alto e basso drought test in campo, non in serra. Fanno vedere la differenza per ognuna delle 8 linee.
        Hanno utilizzato come unità di misura il bushel per acro, che sarebbe la quantità di pannocchie in dei contenitori tarati specifici per mais. La produzione è aumentata in confronto al controllo in alto e basso stress
        
        In questo studio, il costrutto è stato unito al promotore UB1, si è visto che però non era un ottimo promotore (non dice perché).
        In un’altra ricerca della DuPont (azienda), si esplora un gruppo di 400 diverse linee di mais per vedee ARGOS8, ma i livelli di espressione non erano comparabili (troppo bassi) con quelli delle linee transgeniche, quindi il punto è che la linea fatta con il 35s è una linea transgenica, con i vari problemi che porta.
        Per vedere se già esisteva in natura, sono state analizzate 400 linee diverse ma non c’è stato un riscontro positivo, questo perché le piante in natura devono rispondere allo stress per sopravvivere.
        
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        Lo scopo è ottenere piante resistenti alla siccità mediante la regolazione di ARGOS8, ma senza passare dal promotore 35S. di conseguenza, non otterremo un transgene, e soprattutto la modulazione può essere più “pacata” evitando eventuali squilibri che potrebbero essere causati da un promotore così forte
        
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