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CAPITOLO 3: AMMINOACIDI, PEPTIDI E PROTEINE - Coggle Diagram

- - - - Esempi di amminoacidi che derivano da modificazioni post-sintetiche 
        Tra questi vi sono per esempio la 4-idrossiprolina, un derivato della prolina che si ritrova nel collagene, una proteina fibrosa, e il gamma-carbossiglutammato, presente nella protrombina, una proteina che partecipa al processo di coagulazione del sangue, e in altre proteine che legano il calcio per svolgere le loro funzioni metaboliche. Molto più complesso è l’amminoacido desmosima, un derivato di quattro residui di lisina presente nella proteina fibrosa elastina.
  - - - Proprietà acido-base con gruppo R non ionizzabile
        Gli amminoacidi con un solo gruppo alfa-amminico, un solo gruppo alfa-carbossilico e un gruppo R non ionizzabile hanno curve di titolazione che ricordano quella della glicina. Questo gruppo di amminoacidi ha valori di pKa molto simili, anche se non identici: il pKa del gruppo -COOH varia tra 1,8 e 2,4 e il pKa del gruppo -NH3+ tra 8,8 e 11,0. Le differenze di questi valori di pKa riflettono la tipologia dell’intorno chimico determinato dai loro gruppi R.
      - Proprietà acido-base con gruppo R ionizzabile
        In secondo luogo, gli amminoacidi con un gruppo R ionizzabile hanno curve di titolazione più complesse, con tre fasi corrispondenti alle tre possibili tappe di ionizzazione; quindi, tali amminoacidi avranno tre valori di pKa. La terza fase di titolazione del gruppo R ionizzabile si sovrappone parzialmente a quella della titolazione del gruppo alfa-carbossilico, a quella della titolazione del gruppo alfa-amminico, o a entrambe.
      - Il caso particolare dell’istidina
        In condizioni di completa esposizione all’ambiente acquoso, l’istidina è il solo amminoacido che ha un gruppo R con pKa di 6,0 e può così comportarsi da tampone a un pH vicino alla neutralità, condizione che di solito si ritrova nei fluidi intracellulari ed extracellulari della maggior parte degli animali e dei batteri.
- - - - Cromatografia a scambio ionico
        La cromatografia a scambio ionico sfrutta le differenze del tipo e dell’intensità della carica elettrica netta delle proteine a un certo pH. La matrice della colonna è un polimero sintetico (resina) contenente gruppi carichi. I polimeri con gruppi carichi negativamente sono detti resine a scambio cationico e quelli con gruppi carichi positivamente resine a scambio anionico. L’affinità di ciascuna proteina per i gruppi carichi della colonna dipende dal pH che determina lo stato di ionizzazione della molecole e dalla concentrazione dei sali presenti nella soluzione della fase mobile. La separazione può essere ottimizzata variando gradualmente il pH e/o la concentrazione saline della fase mobile, in modo da creare un gradiente di pH o un gradiente salino.
      - Cromatografia a scambio cationico
        Nella cromatografia a scambio cationico, le proteine con una carica netta positiva migrano attraverso la matrice più lentamente di quelle con una carica netta negativa, in quanto la migrazione delle prime viene ritardata dall’interazione con la fase stazionaria. Man mano che la soluzione contenente le proteine fuoriesce dalla colonna, porzioni successive dell’eluito (frazioni) vengono raccolte in una serie di provette. Le singole frazioni vengono analizzate per rilevare la presenza della proteina di interesse e anche per misurare altri parametri, come la forza ionica o la concentrazione proteica totale. Tutte le frazioni che risultano contenere la proteina di interesse vengono riunite e costituiscono il prodotto finale di questa tappa cromatografia della purificazione proteica.
      - Cromatografia per esclusione molecolare o gel-filtrazione
        La cromatografia per esclusione molecolare, detta anche gel-filtrazione, separa le proteine secondo la loro dimensione: le proteine più grandi eluiscono prima di quelle più piccole, un risultato che può sembrare strano. Infatti, la fase solida è costituita da granuli di polimeri intrecciati fra loro che creano al loro interno pori o cavità di particolari dimensioni. Le proteine più grandi non possono entrare nelle cavità e quindi attraversano la colonna più rapidamente, percorrendo un cammino più breve e per questo più rapido, intorno ai granuli. Invece le proteine più piccole penetrano nelle cavità e vengono rallentate dal loro percorso più tortuoso attraverso la colonna. La cromatografie per esclusione molecolare può essere utilizzata anche per determinare approssimativamente la dimensione di una proteina durante il suo processo di purificazione.
      - Cromatografia per affinità
        La cromatografia per affinità si basa sulla formazione di legami specifici. I granuli con cui viene riempita la colonna solo legati covalentemente a un gruppo chimico chiamato ligando, un gruppo o una molecola in grado di interagire con una macromolecola come una proteina. Quando si aggiunge alla colonna una miscela di proteine, ogni specie proteica che ha affinità per il ligando si lega ai granuli, quindi la sua migrazione attraverso la matrice viene rallentata. Per esempio, se la funzione biologica della proteina che si vuole purificare comporta il legame con l’ATP, legare una molecola molto simile all’ATP si granuli con cui si prepara la colonna permette di realizzare una matrice che potrà essere di grande utilità per purificare la proteina. Le proteine che non si legano all’ATP fluiscono più rapidamente attraverso la colonna. Le proteine legate sono poi eluite da una soluzione contenente un’elevata concentrazione salina o il ligando libero, in questo caso l’ATP o una molecola analoga all’ATP. Il sale indebolisce il legame della proteina con il ligando immobilizzato, interferendo con le interazioni ioniche. Il ligando libero compete con il ligando attaccato ai granuli, staccando la proteina dalla matrice; la proteina che eluisce dalla colonna spesso è associata al ligando usato per eluirla.
      - Cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC
        La risoluzione delle metodiche cromatografie può essere incrementata dalla cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC, che utilizza pompe ad altra pressione per aumentare la velocità delle molecole proteiche attraverso la colonna, e matrici cromatografie di elevata qualità, in grado di sopportare forti pressioni. Riducendo il tempo di transito attraverso la colonna, l’HPLC limita la dispersione delle bande proteiche causata dalla diffusione e quindi migliora notevolmente la risoluzione.
  - - - Elettroforesi bidimensionale
        Combinando l’isoelettrofocalizzazione con l’elettroforesi su SDS in una tecnica chiamata elettroforesi bidimensionale, è possibile ottenere la risoluzione di una miscela complessa di proteine.
- - - - Ionizzazione nel vuoto
        Le molecole che devono essere analizzate, dette anche analiti, sono prima ionizzate nel vuoto. Quando le molecole, così dotate di carica elettrica, vengono introdotte in un campo elettrico e/o magnetico, il percorso che compiono diventa funzione del loro rapporto massa/carica. Poiché le misure di m/z venivano effettuate su molecole in fase gassosa, l’uso della spettrometria di massa è stato a lungo limitato a specie di piccole dimensioni.
        
        MALDI MS
        Nel 1988, però, sono state sviluppate due nuove tecniche per portare le macromolecole in fase gassosa evitandone la decomposizione, e ciò ha rivoluzionato il sequenziamento proteico. In una di queste tecniche, le proteine sono poste in una matrice che assorbe luce: con un breve impulso di luce laser le proteine sono ionizzate e poi deassorbite dalla matrice solida e rilasciate in un sistema sotto vuoto. Questa tecnica, nota con l’acronimo MALDI MS, spettrometria di massa con ionizzazione e desorbimento laser assistita dalla matrice, è stata usata con successo per misurare la massa in una grande varietà di macromolecole.
        
        ESI MS
        In un secondo metodo, le macromolecole sono forzate a passare direttamente dal liquido alla fase gassosa. La soluzione di analiti passa attraverso un ago carico mantenuto a un alto potenziale elettrico e viene dispersa sotto forma di una “nebbia” di microgocce cariche. Il solvente che circonda le macromolecole evapora rapidamente, lasciando nella fase gassosa ioni macromolecolari dotati di cariche multiple. Questa tecnica è detta spettrometria di massa con ionizzazione a elettronebulizzazione, o più semplicemente ESI MS. I protoni aggiunti durante il passaggio attraverso l’ago portano cariche aggiuntive alla macromolecola. Il rapporto m/z può essere analizzato nella camera a vuoto.
        
        TOF
        Un metodo per analizzare m/z, chiamato tempo di volo o TOF, si basa sulla dipendenza da m/z dell’accelerazione degli ioni in un campo elettrico.
        
        Orbitap
        Un metodo ancora più nuovo ed efficiente è l’Orbitap: il nome deriva dal fatto che gli ioni sono intrappolati in un’orbita tra un elettrodo esterno, a forma di barile, e uno interno a mandarino. La traiettoria degli elettroni, che è correlata alla loro massa e alla loro carica, viene rilevata dallo strumento e convertita in un valore di m/z da una trasformata di Fourier.