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FITOTECNOLOGIE PER RISANARE SOLI E ACQUE, ADSORBIMENTO DEI CONTAMINANTI…

- - - - CONTAMINATI ORANICI
        si tratta Diossine, policloro bifenili, PCB (lindano, γHCH),idrocarburi butano etano ecc..( possono essere biodegradati da enzimi),idrocarburi policiclici aromatici IPA (benzene, toluene, xylene), composti organici volatili (isomeri del lindano, pesticida largamente utilizzato che è stato in grado di risalire la catena alimentare e si ritrovava in carne e latte), farmaci tipo ibuprofene, TNT
      - Contaminanti inorganici (elementi tossici per l’uomo):
        metalli pesanti come Cadmio, Piombo, Mercurio, Rame, Zinco, Cromo, Nichel e metalloidi come Arsenico (la cui presenza può essere ricondotta ad origine antropica sia presenza a livello di suoli di origine vulcanica e ce lo portiamo nelle acque che ci passano attraverso) e Selenio, Cobalto, Rame (essenziali a basse concentrazioni) Fluoruri, Solfati, Nitriti, Boro e Cianuri. Questi contaminanti provengonoprincialmente da industrie e batterie
    - - Sono specie in grado di assorbire e traslocare il contaminante.
        Questo termine si usa soprattutto per i contaminanti di tipo inorganico perché, essendo metalli pesanti, non possono essere degradati.
        Nel caso di suolo contaminato da metalli pesanti trattato in maniera chimica andrà a produrre degli scarti ricchi, anch’essi, di contaminanti.
        Se utilizzo una pianta per fare lo stesso lavoro ho il vantaggio che una volta secca riduco notevolmente peso e volume.
        processo d’accumulo a livello radicale
        
        esempi
        
        Thlaspi Arabidopsis e Alissum sono braissicaee impiegate anche nella produzione di biofiuel.
        
        Alissum è stata utilizzata nel phitominig ovvero l’estrazione da cava di composti d’interesse (estrazione di metalli utilizzando le piante).
        
        Vantaggi:
        
        Questa metodologia ha un impatto paesaggistico positivo rispetto ai metodi di messa in sicurezza
        
        permette di mantenere il terreno attivo ed evitare che la matrice suolo diventi inutilizzabile.
        
        svantaggi:
        
        le piante che iperaccumulano sono piante con biomassa ridotta. Questo problema si potrebbe ovviare con ingenieria genetica o crisprcas-9
        
        tollerano/ accumulano solo 1\2 specie di contaminanti(sono molto specifiche)
        
        Nelle iperaccumulatrci, piante che traslocano, possono esserci dei processi di fitodegradazione a livello radicale che permette una traslocazione
    - - esempi di piante:
        
        Cannabis Sativa e Sopulus spp: sono specie in grado di accumulare si contaminanti organici che inorganici
        
        Helianthus annus: contaminati organici, inorganici e contaminati radionuclidi.
        
        Sopulus spp: si usa una varietà “short rooth” al fine di recuperare con facilità le radici. Questo tipo di piante può evitare il percolamento dei contaminanti all’interno delle falde
        
        Phragmites australis: utilizzato per le acque contaminate specialmente per le contaminazioni da farmaci specialmente FANS e FAS
      - vantaggi:
        
        hanno una biomassa maggiore e possono accumulare diversi tipi di contaminanti sia organici che inorganici
      - i processi riguarderanno l’apparato radicale sono importanti nel processo d’accumulo a livello radicale rizofiltrazione, fitoestrazion, fitostabilizzazione.
        Sono processi che tramite gli essudati radicali trattiene o modificare la bidisponibilità dei contaminati evitandone la mobilità.
- - - - esempi:
        
        Gelso, melo, arancio e menta vanno a degradare i Policlorbifenili (PCB) rendono disponibili per la cellula i prodotti della degradazione
        
        Erba medica, pino, soia>TCE, TCA; SEGALE SORGO>TPH; Graminacee> PAH; BTX pioppo
    - - -Dealogenasi
        rimuovono sottogruppi degli alogeni presenti nei composti organici (nei PCB è gruppo che conferisce un elevata reattività alla molecola)
      - Ossigenasi:
        catalizzano l’ossidazione di contaminanti organici come idrocarburi alifatici;
      - Nitroreduttasi:
        riducono composti azotati come il TNT.
      - esempio
        Pioppo, salice, quercia → Solventi clorurati (TCE, TCA), Pesticidi, TNT, Fenoli
  - - - Peterson, 1971 –Organismo capace di accumulare un elemento fino a concentrazioni superiori a quelle riscontrabili nel mezzo e a quelle riscontrabili normalmente in quell’organismo
      - Baker and Brooks, 1989 - Piante capaci di accumulare concentrazioni di metalli 100 volte superiori rispetto a quelle accumulate dalle altre specie vegetali
      - Reeves, 1992 -Piante capaci di accumulare metalli a concentrazioni 100 volte superiori rispetto alle concentrazioni presenti nelle stesse piante cresciute in suoli non contaminati.
    - - 10, 100: iperaccumulatori
        1: accumulatori
        = 1: indicatori (muschi e licheni sono in grado di crescere in aree contaminati)
        < 1: esclusori
      - Il BAF e il TF li usiamo negli esperimenti di intercropping sia per capire l’efficienza delle piante che utilizziamo come co-cultura sia per valutare l’assorbimneto del contaminante da parte della specie controllo
    - - La sostanziale differenza tra il BCF e la Remediation Capacity è che il primo considera solo le concentrazioni, mentre la seconda è indicativa sia della concentrazione che della produzione di biomassa.
  - - - Acidi organici
        il citrato forma complessi con Fe, Cd, Ni (T. goesingense), il malato con lo Zn (A. halleri) e il Cd (T. caerulescens)
      - Aminoacidi
        Istidina forma complessi con il Ni, NA (aminocarbossilato), è un amminoacido derivato dalla condensazione di tre S- adenosil metionine (precursore dell’Acido mugineico una molecola che lega Fe, Cu, Zn)
      - Peptidi
        come Fitochelatine sintesi enzimatica fatte di unità ripetute gamma-clutammeto e cisteine e termina con una glicina (c-Glu-Cys)nGly(n=2-11)
        sono specie e tessuto specifici l’elemento limeita per la formazione delle fitochelatine è la fitochelatina sintasi che si occupa di polimerizzare le unità dipeptidiche.
        
        I metalli pesanti scatenano una serie di risposte che porta all’attivazione della sintesi di fitochelatina sintasi
        (+ metallo🡪+ fitochelatinasintasi -> + fitochelatine = + metallo complessato) + presente nelle accumulatrici
      - Proteine
        come Metallotioneine, MTs, sono proteine a basso peso molecolare, Ricche di Cysteine, sintetizzate e attivate sintetizzate e attivate in presenza di HM come: Cd, Zn, Cu. + presente nelle accumulatrici
    - - I contaminanti inorganici vengono sequestrati all’interno del vacuolo, mediante trasportatori presenti sul tonoplasto.
        Il dominio più è importante nucleotide binding domain che lega l’ATP cambia conformazione al trasportatore e quindi permette l’ingresso della sostanza nel vacuolo
        La parte trasnmembrana si occupa di riconoscere la molecola
      - i trasportatori sono un po’ generici e ridondanti
        Le principali famiglie di trasportatori coinvolti sono:
        
        ABC
        (caratterizzati da trans membrana e citosolici) MRP and PDR sono i principali fattori coinvolti nell’accumulo all’interno del vacuolo (HMT1, in Schizosaccharomyces pombe, ABCC 1-2-3 in Saccharomyces Caerevisiae, trasportano PC-Cd nel vacuolo
        
        focus su ABCC utilizzano l’ATP
        
        Caratterizzati da 3 domini transmembrana ognuno con sei subunità transmenbrana e 2 nucleotinebining domain.
        Queste sono responsabili (già citati in una lezione sulla PCR in cui ci sono state spiegate le funzioni ABCC1-2-3 ridondante nella vacuolorizzazione del cadmio) sono trasportatori con funzione di trasportare in maniera specifica: complesso fitochelatine-metalli pesanti.
        
        Sono in grado di legare e spostare nel vacuolo quelle che sono xenobiotici.
        Essendo quest’ultimi organici non hanno bisogno di essere complessati
        La professoressa porta l’esempio di piante che esprimono il promotore per ABCC3 trasportatore vacuolare presente sul tonoplasto legato al GAS ripojndono meglio ad As Cd
        
        CDF, o MTP
        (metal tolerance protein), trasportano Zn2+, Cd2+, Co2+, Ni2+, or Mn2+ dal citoplasma al vacuolo.
        
        NRAMP
        Fe2+, Mn2+ , Zn2+, Co2+, Cd2+, Cu2+, Ni2+, Pb2+
        
        trasportato MATE
        Promuovono l vacuolizzazione e ingresso attraverso un gradiente ionico
    - - fine del lavoro è andare a caratterizzare questo trasportatore delle crocine presente negli stigmi dello zafferano.
        Lo scopo è quello di over produrre le crocine in pianta o farlo, in futuro, a produrle in altre piante o in batteri
      - Zeaxantina è apocarotenoide,
        sintesi : viene prodotto nei plastidi dei cromoplasti a partire dal beta carotene che per taglio diventa una crocetina-ialdeide —> passa attraverso il reticolo endoplasmatico e in fine nel tonoplasto attraverso dei passaggi mediati da diversi enzimi di deidrogenazione e glicosilazione per arrivare ad una crocetina attiva e funzionale.
        
        È stata effettuata una trascrittomica sugli stigmi per analizzare per omologia con arabidopsis per i trasportatori ABC.
        
        I trasportatori ABC sono espressi nel tonoplasto e sapendo che la sintesi delle crocine ha diversi step : cromoplasto—> citosol—> RE —> vacuolo dove restano attive.
        Si è ipotizzato che lo step limitante potesse essere il trasporto a carco quindi dei trasportatori ci sono nel vacuolo: MATE e ABCC.
        
        Come lo faccio nella pratica?
        
        STEP 1:
        Raccolgo gli stigmi estraggo l’RNA lo sequenzio e ottengo sequenze codificanti dalle quali per omologie con arabidopsis risalgo ai nostri trasportatori d’interesse.
        
        È risultato che solo 11 dei trasportatori venivano espressi solo il ABCC era espresso solo nello stigma.
        
        STEP 2:
        Hanno effetuato una co-trasformazione per capire se ci fossero dei trasportatori isolati ( significa clonare ognuno dei trasportatori isolati insieme al primo enzima della sintesi dello zafferano+ il composto legato dal trasportatore nel caso la crocina.
        
        Hanno trovato un coefficiente di correlazione tra l’espressione del trasportatore del composto che viene trasportato e del primo enzima di sintesi delle crocine molto alto per ABCC4a
        
        STEP 3
        CO-LOCALIZZAZIONE
        
        Consiste nel co-tarsformazione per argroinfiltrazione transiente (trasformazione transiente inoculando una foglia e pii valutano dopo 1/3 giorni essa non prevede l’integrazione nel genoma nalla stabile rimane e viene trasferita alla progenie).
        
        Vanno a far esprimere il nostro gene d’interessa fuso alla GFP in parallelo trasformano con un marcatore del RE il ɣ-TIP
        
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      - seminario enea zafferano
        
        piccola intro
        
        Metaboliti derivano da trasformazioni di substrati ad opera degli enzimi, le vie metaboliche sono numerose all’interno di una cellula, i metaboliti sono molti e ancora da scoprire.
        
        Storicamente l’uso delle piante nella medicina è stato ampiamente documentato, secondo testi cinesi si curava la febbre con estratto della pianta Artemisia annua, 1600 anni dopo una chimica vince il premio Nobel per la medicina scoprendo il principio attivo di questa pianta “Artemisina”, attualmente usata negli antimalarici.
        
        Il metabolismo primario è quello che partecipa alla crescita e sviluppo della pianta (amminoacidi, zuccheri),
        quello specializzato (derivati di zuccheri amminoacidi…) invece deriva dal primario ma non comprende metaboliti essenziali, ma solo quelli hanno il ruolo di aumentarne la fitness
        
        Alcaloidi (Morfina)
        
        Fenilpropanoidi (Flavonoidi e gli Antociani)
        
        Terpenoidi (Artemisinina, Tassolo)
        
        I metaboliti specializzati
        non sono costitutivinella pianta, possono essere prodotti in determinati organi e in determinate condizioni (ad esempio di stress) della pianta.
        Alcuni esempi sono:
        
        Licopene (da il colore rosso al pomodoro, si accumula nel frutto)
        
        le Crocine (solo negli stigmi del fiore di zafferano),
        
        la Curcumina solo nelle radici
        
        il Mentolo il mentolo che è volatile, viene accumulato in papille esterne sulla foglia chiamate tricomi ghiandolari, quando si sfrega la foglia di menta, rompiamo i tricomi che rilasciano la sostanza volatile..
        
        Alcuni metaboliti si accumulano in determinate posizioni in base alle loro caratteristiche chimiche
        Lo stesso vale per l’Artemisinina che è una sostanza inodore che si accumula nei tricomi ghiandolari, stesso discorso per il THC e Linanolo (Lavanda).
        
        possono esserci anche determinate cellule deputate all’accumulo;
        esempio
        la biosintesi della morfina comprende 3 tipi cellulari diversi, ma solo le cellule finali sono quelle che rilasciano questo essudato lattico che contiene morfina,
        la stessa cosa avviene in Catharanthus roseus che nei fiori si accumula il precursore di una molecola che si chiama Vinblastina e un suo analogo Vincristina che vengono utilizzate nei protocolli dei chemioterapici.
        Vengono estratti e prodotti per sintesi semichimica.
        
        ci sono anche dei compartimenti subcellulari deputati all’accumulo,
        esempio
        in zafferano, le crucine sono solo negli stigmi ma in particolare si accumulano nei vacuoli, cosa comune nelle molecole idrofiliche.
        
        Quale è il modus operandi per commercializzare un prodotto derivante da questi metaboliti ?
        
        estrarlo e purificarlo facilmente,
        
        produrlo in grandi quantità e a bassi costi.
        
        Il Paclitaxel
        (Terpene) isolato dalla corteccia del tasso del pacifico (presente solo in nord america), viene usato per molti tipi di tumori, ma molto complicato da produrre e molto costoso, si rovinavano gli alberi e l’estrazione era molto difficile.
        Si provò a produrlo per sintesi chimica, ma i costi erano troppo eccessivi, si arrivò all’approccio semi sintetico ovvero a partire dal suo suo precursore che si accumula negli aghi del tasso europeo, più abbondante e facile da estrarre fino ad arrivare al Paclitaxel per sintesi chimica.
        Si è ancora migliorata la produzione con un approccio biotecnologico: le cellule di tasso crescevano in coltura, in bioreattori in laboratorio
        
        L’ingegneria metabolica è molto utile, possiamo:
        
        silenziare via metaboliche endogene dell’ospite,
        
        introdurre nuove vie metaboliche oltre a quelle preesistenti anche con approcci sinteitici,
        
        esempio enzimi che non esistono in natura; ci sono varie strategie messe in atto dall’energia metabolica:
        
        Aumentare quantità del precursore: ad esempio se so che un metabolita si forma a partire dal Licopene scelgo come organismo ospite il pomodoro che ne contiene tanto.
        
        Overespressione dei geni che regolano una reazione limitante: servono tutti gli enzimi per un prodotto ma in genere c’è sempre quell’enzima che è un fattore limitante. (la prof fa l’esempio della via di biosintesi del Beta-Carotene, dice che in quel caso il precursore è Geranilgeranil pirofosfato e l’enzima limitante la fitoene sintasi)
        
        Eliminare inibizioni da feedback
        
        Migliorare la compartimentazione: come nel vacuolo
        
        Over esprimere geni regolatori.
        
        caso studio
        
        lo zafferano sono gli stigmi essiccati di Crocus sativus, costano molto per fare 1kg di zafferano servono 150 000 fiori, sono raccolti a mano e in sale separate si separano gli stigmi dal resto del fiore, è una pianta sterile che l’uomo ha selezionato per vari incroci, ibridi triploidi che producono di più perché sono poliploidi ma al costo della sterilità.
        
        Il genoma è di 11 Gb, l’uomo ha 3 Gb. I produttori maggiori sono Italia Grecia e Spagna, l’Iran ha 90% della produzione ma di basso costo.
        
        Lo zafferano viene utilizzato anche nell’industria dei coloranti e dei cosmetici;
        i metaboliti dello zafferano, le crocine, classificate come apocarotenoidi, derivano dal taglio enzimatico dei carotenoidi e allo scheletro idrocarburico rimanente si legano degli zuccheri, in base a quanti zuccheri sono legati si chiamano crocina 1,2…
        
        Nell’uomo i carotenoidi sono antiossidanti e precursori della vitamina A;
        si trovano nei plastidi insieme alle clorofille o nei cromopalsti dove sono assenti clorofille o negli amiloplasti con l’amido.
        Gli apocarotenoidi derivano dai carotenoidi ma hanno una serie di funzioni nello sviluppo della pianta, interazione delle micorrizze, e alcuni riducono la proliferazione tumorale.
        
        Gli apocarotenoidi derivano dai carotenoidi ma hanno una serie di funzioni nello sviluppo della pianta, interazione delle micorrizze, e alcuni riducono la proliferazione tumorale.
        
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        Nello zafferano si formano crocine da una parte e le molecole residue rilasciate portano ad altre molecole responsabili del sapore ed aroma.
        Una funzione certa delle crocine è la prevenzione della degenerazione maculare correlata all’età, malattia dell’occhio (macula) che con raggi solari si deteriora e porta a ridotta visibilità nella vecchiaia, non c’è una terapia per questa malattia, si è visto che fornendo crocine a topi di Lab si verificava una regressione della malattia, un’azienda dell’Aquila ha individuato l’occasione e crea pasticche nutraceutici (vitamine) con zafferano purissimo molto costoso.
        
        Si cercano nuove fonti di crocine, da altre piante dello stesso genere, o da altre parti del mondo. I biotecnologi cercano di individuare la via metabolica della crocina e bioingegnerizzarla in altri organismi per crearla in maniera meno costosa.
        
        biosintesi delle crocine in zafferano
        -lo studio-
        
        -cosa sappiamo-
        Il punto di inizio deve essere un carotenoide che sono nei cromoplasti/cloroplasti degli stigmi e il punto finale erano i vacuoli, come si spostano da un organo all’altro?
        si sapeva che nei cromoplasti c’era la Zeaxantina e il Beta-Carotene, il precursore doveva essere uno di questi due,
        si sapeva che doveva esserci CCD, Aldeide deidrogenasi per detossificare e un’enzima che sintetizza estremità zuccherine, glucosil trasferasi.
        
        -patway discovery-
        abbiamo bisogno di dati genomici,
        hanno fatto un trascrittoma e analizzano i livelli di espressione del trascritto di interesse,
        se io so che il mio composto si produce in foglia e non in radice, confronto il livello di espressione per capire se il gene è un buon candidato.
        confronto i miei risultati di trascrittomica con l’espressione dei metaboliti di interesse.
        Si è correlata l’attivazione dei diversi geni con i livelli di metaboliti si è capito quale era il massimo di produzione di crocine negli stigmi.
        Si è fatta la filogenesi con confronto in letteratura, proteomica per vedere le proteine espresse, ha fatto western blot con anticorpi che hanno fatto vedere la presenza di questo enzima solo negli stigmi.
        
        come dimostro che quell'enzima da quella sezione metabolica?
        prendo il gene, lo metto in un organismo ospite, vado saggiarne la funzione enzimatica. CCD2 immesso in batterio che accumula carotenoidi e dopo che l’enzima riesce a tagliare si ha una discolorazione del substrato perché giustamente il batterio non riesce a glucosilare e quindi il colore si perde.
        In questo modo si è visto che la Zeaxantina con il CCD2 era l’enzima che crea la crocina, per capire dove è localizzato si è agroinfiltrato il tabacco con GFP e RFP, si è usata microscopia a fluorescenza, e si è visto che la fluorescenza dei marcatori era coincidente con quelle delle clorofille, quindi si trova nei cromoplasti.
        
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        -cosa so:-
        Le crocine devono andare nel vacuolo, necessitano di trasporto attivo perché troppo grandi
        -conoscenza prescrisse:-
        si sa che i trasportatori Mate o ABC frequentemente trasportano metaboliti secondari,
        
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        Una volta identificato il patway metabolico delle crocine è pronto per essere immesso in un altro organismo,
        quello che si è fatto è stato far produrre a piante di tabacco molecole bioattive con la tecnica del New Plant Breeding Technique, si fanno 4 colture con 4 enzimi coinvolti nella via biosintetica, si infiltrano e si vede con spettrometro di massa che le crocine che si formano solo mettendo il primo enzima, grazie ai suoi enzimi endogeni la pianta riesce a creare il prodotto finale, quando metto trasportatore di zafferano i livelli aumentano
        .
        Si sono anche usate piante con precursore più alto, seleziono Epsilon Branch, licopene epsylon ciclasi le inattivo in modo tale che mi si crea tanto carotene e tanto zeaxantina, mediante Crispr-Cas9, si è aumentato 1000 volte il contenuto di zeaxantina e 10 volte quello di crocina
        
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- - - - Vengono usati setti in nylon e setti di plastica per separare il riso dalla specie iper-accumulatrice e viene comparata la concentrazione di cadmio nel riso di queste culture con quelle dove non è presente alcun setto.
        In questo studio, inoltre, vengono presi in considerazione diversi stadi di sviluppo del riso fino alla maturazione
      - Anche qui nel chicco di riso in intercultura è possibile osservare una minore concentrazione di cadmio rispetto al riso separato dai setti
- - - - Questo accade per la forma organica dell’arsenico (l’arsenato) che è un analogo chimico del fosfato.
        Essendo un elemento essenziale per la pianta a livello radicale saranno presenti tantissimi trasportatori l’arsenico sfrutta questi trasportatori per entrare nella piante se quest’ultima non è tollerante muore
    - - trasporto attivo attraverso la via simplastica ed i canali attraversa il cortex della radice per arrivare nel sistema vascolare
      - Passivamente attraverso le acquaporine e le vie apoplastiche intercellulare per arrivare al vascolare
    - - transmembrana
        
        MATE
        MATE esporta composti cationici utilizzando il gradiente elettrochimico di H+ o Na+ come forza motrice e funziona come uno scambiatore elettroneutrale.
        
        ABC
        I trasportatori ABC esportano i loro substrati utilizzando l'energia dell'idrolisi dell'ATP come forza motrice.
        
        Gli ABCc sono trasportatori tipici del tonoplasto e possono trovarsi in alcuni casi sulla membrana plasmatica
        
        hanno in comune*
        
        sono molto grandi (con geni altrettanto grandi e difficili da clonare) caratterizzati da domini transmembrana e citosolici
        
        I domini citosolici legano l’atp e sono quindi trasportatori attivi che richiedono energia. Quando l’atp si lega al trasportatore ne causa un cambiamento conformazionale che permette l’ingresso della molecola di interesse.
      - identificazione e isolamento dei trasportatori
        nel caso del crocus sativus come è stato trovato il trasportatore responsabile della vacuolizzazione delle crocine?
        
        step 1
        sappiamo che le crocine vengono prodotte solo negli stigmi.
        Una volta identificata la via di biosintesi delle crocine e sapendo che vengono accumulate nel vacuolo i trasportatori possibili sono solo MATE o ABC
        
        Un approccio estrarre tutto l’rna dagli stigmi e fare una trascrittomica sequenziando quindi i geni che vengono espressi.
        Facendo questo si è potuto vedere che 4 trasportatori venivano sovraespressi, in particolare il 4a che è espresso solo negli stigmi
        
        Per verificare che i trasportatori sono espressi sul tonoplasto si fa un saggio di coinfiltrazione su foglie di N. tabacum, ossia un’espressione transiente del trasportatore fuso a un gene reporter (gfp) e un marker specifico del tonoplasto (GammaTIP) fuso anchesso a un gene reporter che fluoresce a una lunghezza d’onda diversa.
        Osservando i due segnali al microscopio e facendo un merge dei due segnali possiamo verificare in quale zona della cellula viene espresso il nostro gene di interesse.
        
        Un segnale sul giallo-verde indica la coespressione del nostro trasportatore e del GammaTIP sul tonoplasto. Da questa analisi tutti i trasportatori risultano localizzati sul tonoplasto
        
        step 2
        Bisogna adesso confermare che il trasportatore ABCc4 leghi la crocina, per fare ciò occorre fare un saggio di trasportomica
        
        Cloniamo il trasportatore nel lievito e si isolano i microsomi (piccole sezioni di membrana) e si verifica se c’è stata una corretta espressione del nostro gene eterologo;
        successivamente si incubano i microsomi in presenza del substrato di interesse (in questo caso le crocine isolate dallo stigma).
        
        Espressione dei cinque trasportatori di C. sa-vus nelle cellule di lievito, > Isolamento di microsomi da cellule trasformate di lievito
        
        Incubazione di microsomi sovraesprimenti un trasportatore con estratto idroalcolico di C. saPvus sPgma in presenza di ATP.
        
        I metaboliti trasportati legati al microsoma sono stati eluiti e quantificati da LC-PDA-HRMS.
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        I trasportatori CsABCC4a CsABCC2 trasportati, cis-crocina 3 e trans-crocina 2, trans-crocina 1
        MATE erano in grado di trasportare solo glicosidi flavonoidi
        
        Analizzando allo spettrometro andiamo a confermare la presenza del legame trasportatore-substrato che si vede sottoforma di picchi corrispondenti alle crocine e picchi corrispondenti al substrato
        
        I microsomi vengono utilizzati in laboratorio per imitare l'attività del reticolo endoplasmatico in vitro e condurre esperimenti che richiedono la sintesi proteica su una membrana; forniscono agli scienziati un modo per capire come vengono prodotte le proteine nell'ER in una cellula ricostituendo il processo in una provetta.
        
        Si è effettuato un saggio co-localizzazione per verificare che l’espressione del trasportatore fosse specifica al tonoplasto e non ad altre zone della cellula.
        Si ripete il saggio utilizzando quindi marker specifici per la membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico.
        Il coefficiente di correlazione più alto si trova dal merging dell’immagine del marcatore e del tonoplasto confermando quindi la nostra ipotesi.