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SINTETIC BIOLOGY, produzione di piante a basso contenuto di glutine,…

- - - - In pianta i processi metabolici che vengono modificati sono soprattutto quelli che producono metaboliti secondari:
        
        sovraespressione
        
        espressione di componenti eterologhe che influiscono su un dato pathway metabolico
    - - Terpeni,
        composti lipidici costituiti da unità isopreniche, comprendono olii essenziali o resine con proprietà antitumorali o antimalariche (tassolo, artemisina)
      - Composti fenolici,
        derivati dall’amminoacidi fenilalanina e caratterizzati da uno o più gruppi fenolici, hanno azione preventiva nei confronti di molte malattie degenerative, o infiammatorie come nel caso delle antocianine.
        Presenti in tutte quelle piante caratterizzate da colori rossi o tendenti al viola.
      - Composti azotati
        derivati dagli amminoacidi, come gli alcaloidi, con proprietà antidolorifica (morfine) e antitumorale (vincristine e vinblastine) o stimolante (caffeina, nicotina).
    - - Si comincia dalla conversione dei pathway in organismi semplici per lo studio
        
        esempio
        il pathway del Beta-carotene o dei carotenoidi in generale.
        Il beta-carotene, precursore della vitamina A, nelle piante è prodotto e confinato a livello dei plastidi.
        è presente negli organi vegetativi ma non nel chicco (si nella cuticola esterna che viene tolta)
        si è pensato di usare l'ingeneri genetica(al posto del breding) per ottenere riso a basso costo ma ricco di vitamina A GOLDEN RICE
        
        Questo (carenza di vitamina A nell’alimentazione) comporta un certo problema nei paesi più poveri.
        
        In questo caso la conversione del pathway è semplice poiché già presente in organismi unicellulari.
        Dallo studio delle componenti che portano al prodotto di interesse, quello che si è riusciti a costruire (nel caso del beta-carotene e delle astaxantine) è stato l’integrazione di una serie di geni codificanti enzimi che portano alla sintesi del precursore del beta-carotene.
        
        due enizimi sono stati studiati in particolare:
        
        la carotene-desaturasi batterica
        
        la fitoene sintasi della pianta del narciso
        
        Questi sono stati fatti esprimere specificatamente nell’endoderma del riso, portando ad un aumento della sintesi di beta-carotene in questo tessuto
        
        PATWAY SINTESI DEI BETACAROTENOIDI
        metileritritol fosfato (MEP),
        alternativo alla via del mevalonato.
        
        pathway che avviene all’interno dei plastidi, che porta alla formazione GGPP (Geranilgeranil pirofosfato).
        Questo è il substrato che porta poi alla sintesi del prodotto secondario Licopene e da questo al beta-carotene.
        
        Nei plastidi in realtà tutto questo pathway si ferma al Licopene.
        
        ci viene mostrata la patway alternativa introdotta nel Golden Rice I
        
        Il pathway mediato dai tre enzimi fitoene sintasi (PSY), desaturasi (PDS), e la zeta-carotene desaturasi
        è stato sostituito dai due enzimi fitoene sintasi di narciso (PSY1) integrata insieme alla beta-carotene desaturasi di Erwinia Carotovora (Crtl).
        
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- - - - Il peptide 33-mer, è un peptide che contiene 6 copie di questi 3 epitopi.
      - Con il genome editing è stato mutato il genoma della pianta.
        Con un approccio di RNA interfering (che comunque è stato utilizzato per produrre piante a basso contenuto di glutine) si è agito invece a livello dei trascritti:
        può succedere è che si inneschi un meccanismo che porterà ad una sovraproduzione di glutine, o addirittura ad un silenziamento ma senza knock-out, per cui ci sono dei rischi legati a questo metodo.
    - - andando a mutare il peptide con sgAlpha-2, in realtà si osservarono delle mutazioni anche in altre zone regioni.
        Questo perché quando Cas9 effettua il taglio, si mette in moto il meccanismo di riparo del DNA mediante ricombinazione non omologa, che può portare a mutazioni o perfino inserzioni di pezzi anche importanti. Questo rischio era effettivamente presente nell’utilizzare
        
        Questo rischio era effettivamente presente nell’utilizzare il genome editing, ma nella produzione delle piante transgeniche vennero escluse tutte quelle linee che presentavano queste mutazioni/inserzioni
        
        importante da notare che mutando con sgAlpha-2, in realtà si ottennero delle linee con una percentuale di mutazione più elevata;
        probabilmente perché sgAlpha-1 era altamente tossico e induceva mutazioni in regioni off-target, che codificavano per funzioni vitali.
        
        analisi dell'immagine
        Qui si può osservare un A-PaGE in cui è analizzato il pattern proteico di piante trasformate con sgAlpha-1 e sgAlpha-2.
        Qui si nota che nel caso di sgAlpha-1, nelle due linee mutate e nel wild type, quasi tutto il pathway delle gliadine gamma e omega viene espresse
        In pianta 10 e in pianta 2 trattate con sgAlpha-2, invece, la presenza del pathway proteico delle gamma e alfa è molto meno abbondante.
        Questo è stato notato anche con analisi MALDI-TOF, in cui vengono analizzati in cui vengono analizzati i picchi specifici di ogni peptide, per le piante mutate e per il wild-type.
        
        Questa analisi mi mostra come, nelle piante mutate con sgAlpha-2, il contenuto di gliadine totali sia molto ridotto rispetto a quelle mutate con sgAlpha-1.
      - Le analisi di sequenziamento (Sanger) per confermare l’assenza di mutazioni off-target sono state effettuate prima sui singoli geni codificanti le gliadine, e poi sull’intero genoma delle piante mutate.
        
        Gli anticorpi monoclonali sono stati utilizzati come controllo ulteriore: R5, specifico per il legame con il glutine, e G12 ancor più specifico per il legame con 33-mer.
        Nella pianta 10, la cui quantità di glutine era molto ridotta, effettivamente i due anticorpi non legavano praticamente nulla, ad ulteriore verifica della differenza nel trattamento effettuato con sgAlpha-1 e sgAlpha-2.
        Un ulteriore conferma è stata effettuata mediante analisi con SDS Sedimantion Test.
        
        Le linee mutate con sgAlpha-1 quindi, si confermano non utili per ottenere delle piante prive o con bassa quantità di glutine.
      - l’analisi fenotipica,
        non si osservano differenze tra la pianta mutata e la pianta wild-type, il che è buono poiché correla con l’analisi genetica che mostrava l’assenza di mutazioni off-target.
        Anche i chicchi, presentano stessa forma e dimensioni, e stessa resa.
        La mutazione ottenuta per genoma editing ha quindi colpito solo la specifica zona, cioè il peptide 33-mer che conteneva le 6 copie dei 3 epitopi più immunogenici, creando così una varietà di grano con quantità di glutine significativamente bassa, mantenendo tratti fenotipici (resa etc.) identici.