PCR

si può usare per selezionare le piante in cui ho inserito il costrutto d'interesse

Real-Time PCR (qRT-PCR),

La RT-qPCR, non misura l’accumulo dei prodotti di reazione dopo n cicli ma il numero di cicli necessari per raggiungere una soglia arbitraria di fluorescenza detta Ct (concentration threshold), che cadrà nella regione esponenziale della curva.

permette di valutare la quantità di costrutto o di quantificare l’espressione di un gene in pianta

l'analisi si fa su cDNA

il cDNA è una molecola di DNA sintetizzata in laboratorio a partire dall'RNA messaggero e rappresenta una copia complementare dei geni trascritti in una cellula.

Il processo di sintesi del cDNA è una retrotrascrizione

DNA polimerasi RNA dipendenti generalmente derivate da virus


Inizialmente si utilizzavano trascrittasi inverse che lavoravano insieme ad RNAsi H in modo tale da idrolizzare la molecola eteroduplex DNA-RNA che si veniva a formare in seguito alla polimerizzazione, liberando così il cDNA templato.


Attualmente si usano dei kit caratterizzati da enzimi ricombinanti, prive di RNAsi H ma che lavorano a temperature alle quali l’RNA si degrada.

le più comuni sono Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) e da Avian Myeloblastoma Virus (AMV)

è generalmente seguita da una PCR, utilizzando primer specifici per verificare la presenza di un amplicone e quindi la riuscita della retrotrascrizione.

L’RNA messaggero è caratterizzato da una coda di poliA (estremità 3’) e un cap (estremità 5’), spesso utilizzati per disegnare gli inneschi;

i primer piu utilizzati :

  • voligo dT, complementare alla coda al 3’
  • esameri randomici, che si appaiano in maniera casuale lungo l’RNA
  • primer specifici, per amplificare una specifica regione di interesse, tuttavia questa modalità è generalmente più costosa, perciò generalmente si retrotrascrive l’intera sequenza e si amplifica in PCR con primer specifici.

FORMULE

reazione di amplificazione del DNA è descritta dalla formula:
N(n)= N(0)(1 + E)n


se l'efficienza è massima la formula si riduce a
N(n)= N(0) 2n

N(n) → numero di molecole di DNA al ciclo n

N(0) → numero di molecole di DNA iniziali

(1 + E)n → efficienza dell’amplificazione

La formula descrive una reazione esponenziale può essere meglio evidenziata attraverso i logaritmi
Log N(n) = n log(1 + E) + log N(0)

la PCR può essere utilizzata in modo semiquantitativo

RT-PCR semiquantitativa la reazione viene fermata dopo pochi cicli, evitando così la saturazione, causa di una riduzione dell’efficienza e dovuta a:

  • Inattivazione della Taq polimerasi
  • d'elezione dei primers
  • inibizione da parte del pirofosfato
  • auto appaiamento di dna amplificati

É necessario poi risolvere mediante elettroforesi e visualizzare i risultati attraverso Southern blotting e ibridizzazione con una sonda radioattiva.
Utilizzando programmi di imaging, quindi, si può analizzare l’intensità della fluorescenza e stimare così in maniera indiretta le concentrazioni confrontando tra loro un prodotto rispetto ad un altro.

RT-PCR e qRT-PCR non sono sinonimi! nel primo caso si indica una retrotrascrizione seguita da PCR, nel secondo caso invece ci si riferisce alla quantitative real time PCR.

permette di monitorare di continuo l’andamento della reazione tramite un intercalante fluorescente, come il SYBR Green
sarà quindi possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone il segnale di fluorescenza assorbita con un sistema spettrofotometrico, incluso in un termociclatore, misurando così il ciclo al quale la fluorescenza del prodotto supera la baseline e interseca una linea ideale detta Ct (threshold cycle) posizionata dall’operatore.

Il threshold è una soglia arbitraria di fluorescenza, decisa dall’operatore della real-time, al di sotto della quale i segnali risultano essere aspecifici (non descrivono in modo esponenziale la reazione).
Un campione più concentrato arriva prima alla fluorescenza threshold; il ciclo di “uscita”, ovvero il ciclo al quale viene raggiunto il threshold, fornisce quindi informazioni sulle concentrazione del DNA di partenza.

Il SYBR Green è un fluoroforo che lega in maniera non specifica il solco minore del DNA a doppia elica (dsDNA).
Esistono diversi macchinari utilizzati nella qRT-PCR, generalmente usano una piastra e una luce alogena o a Led, tuttavia esistono anche sistemi a rotore associati ad una luce a Led

CHAMATA Ct
i valori di Ct sono inversamente proporzionali alla concentrazioni iniziali dei DNA target.

DESCRIZIONE

in presenza di due campioni con Ct differente, è possibile calcolare la variazione nei livelli di espressione

N(n)= N(0) 2n


ΔCt = Ciclo1 – Ciclo2


N(ΔCt)= N(0) 2ΔCt


ESEMPIO: calcolo della differenza di espressione tra due geni prima e dopo un trattamento.

1) calcoloCalcolando la differenza tra Ctc e Ctt si ottiene il ΔCt.


Nel caso del controllo, il gene (interleuchina β) esce al ciclo 29; nel caso del trattato, invece, al ciclo 18, ciò vuol dire che il trattato viene espresso di più che nel controllo, senza considerare l’efficenza di amplificazione sarà sufficiente elevare 2 a ΔCt per ottenere il valore della variazione dell’espressione

calcolo:


ΔCt = Ctc - Ctt = 29.63 -18.03 = 11.60
Ratio = 2ΔCt = 211.60 = 3104 volte

questi calcoli sono validi se controllo e trattato hanno lo stesso numero di molecole di DNA per far ciò si utilizzano reference interni ovvero geni housekeeping geni caratterizzati da un'espressione stabile e che quindi vengono espressi allo stesso modo sia nel trattato che nel controllo

Se i due campioni presentano la stessa concentrazione di DNA, i reference saranno espressi allo stesso modo e usciranno allo stesso ciclo; quando ciò accade, la differenza nel livello di espressione del gene in analisi è attendibile.

sei i reference non sono uguali potrebbe dipendere da concentrazioni di DNA differenti
si risolve normalizzando = sottraendo al ΔCt calcolato a partire dai geni in analisi il ΔCt dei geni reference


ΔCt geni reference = Ctc - Ctt
Ratio = 2^ΔΔCt

due formule matematiche per descrivere la fase esponenziale

2^-ΔCt → viene utilizzata per confrontare il livello di espressione del gene target (t) e del gene reference (r)

2^-ΔΔCt → viene utilizzata nella quantificazione relativa, nella quale si comparano le concentrazioni relative di due campioni normalizzati ad un gene di riferimento. Si confronta il ΔCt di un campione trattato (t) e il ΔCt di un campione controllo (c)

L’Efficienza di amplificazione
( dipende dai primer, dalla “pulizia” del DNA, dai parametri sperimentali che possono variare da reazione a reazione) può in alcuni casi essere molto meno del 100%, e quindi non approssimabile a 1.
Per paragonare campioni amplificati con primer diversi con il metodo del ΔΔCT, la loro efficienza di amplificazione deve essere la stessa; quando ciò non accade bisognerà sostituire il “2” con l’efficienza relativa ad ogni coppia di primers, che sarà inferiore a 2. Si parla in questo caso di metodo Pfaffl.

importante:

  • Al ciclo di threshold la fluorescenza è uguale in tutti i campioni;


  • La real time concentra la sua analisi nella curva che esce dal threshold


  • Il threshold viene imposto quando il segnale diventa specifico, ovvero quando la curva esce dal rumore di fondo

La reazione di amplificazione è descritta dai software di real time come una serie di picchi , i cui punti indicheranno la fase di denaturazione (circa 90°C), annealing (dei primers ottimali appaiano a 60°C) e una serie di picchi (circa 72°C).

La reazione di Real-Time dura generalmente 40 cicli. A fine reazione è possibile introdurre una serie di step che descrivono la curva di melting, ovvero la curva che descrive la denaturazione dei prodotti.

Questo è possibile grazie al SYBR Green, in quanto questo si intercala alla doppia elica, perciò maggiore sarà il numero di molecole duplex e maggiore sarà la fluorescenza.

La temperatura del campione viene aumentata in modo incrementale, fino ad arrivare ad un punto di flesso= Indica la temperatura di fusione

temperatura di fusione T°= alla quale metà delle molecole di DNA saranno denaturate

picco di melting T° fusione
La presenza di più picchi indica la presenza di altre molecole di DNA, quindi questo metodo permette di valutare la “pulizia” della reazione e di individuare la presenza di aspecifici.

QUANTIFICAZIONE RELATIVA E ASSOLUTA

RELATIVA

viene utilizzata per confrontare l’espressione di un gene in un mutante e in un wild-type, o in un fenotipo sovraesprimente rispetto ad un wild-type.
L’analisi di confronto non fornisce la quantità esatta dell’amplicone ma il suo grado di espressione rispetto alla condizione wild-type.

si utilizza un gene reporter, questo fornisce un segnale di fondo uguale in tutti i campioni che viene sottratto al segnale specifico

se si utilizzano le nuove PCR cn sistema a rotore non serve ed esse leggono il segnale simgolarmente eliminando in maniera automatica il background

CASO STUDIO
Analisi dell’espressione del gene GH3.2 nel mutante partenocarpico pat rispetto a piante WT di pomodoro

GH3.2 è un gene coinvolto nel metabolismo dell'auxina.
l’enzima codificato da questo gene va a complessare l’auxina rendendola non più disponibile

l'obiettivo dello studio era capire se nel mutane pat esprimesse il gene a livelli superiori o inferiori rispetto il wild-type.

il pat è un mutante partenocarpico è un mutante nel quale il frutto non deriva da un evento di fecondazione e per questo motivo non presenta semi.

La pianta pat e wt non presentano grosse differenze a livello di fusto nei fiori sarà possibile osservare un pistillo detto “a trombetta” in pat, causato dalla ridotta crescita delle antere, fuse nel fiore di pomodoro; la mancata crescita delle antere non permette la fecondazione del pistillo, producendo un frutto senza semi

procedimento analisi:

  1. campionati i fiori, si procede con l’estrazione dell’ RNA dalle antere;


  2. ottenuto l’RNA totale, si retrotrascrive in cDNA solo l’ mRNA, ciò è possibile per opera degli inneschi costituiti da oligo de-T, complementari alla coda di poli-A al 3’ dell’ mRNA


  3. misurata la concentrazione di cDNA e considerata la quantità giusta da utilizzare nelle fasi successive, si procede con l’analisi di Real-Time impostando un threshold.




  1. la fase finale consiste nell’analisi statistica, effettuata attraverso la formula 2-ΔΔCT

STATISTICA

scarto quadratico medio l’errore si propaga in modo esponenziale

per verificare la significatività

t-Test per due campioni

anova per più campioni

t-test unpaired quando si analizzando due gruppi indipendenti (misure provenienti da due campioni diversi)

t-test paired quando si analizzando più campioni (come tre genotipi o tre condizioni diversi),

LIVACK

tra i più utilizzati del 2001
In questo esperimento è stato visto il livello di espressione nel cervello e nei reni
producendo più repliche sia per il gene reference (GAPDH) che per il gene target (c-myc); calcolando poi i ΔCt, il ΔΔCt ed infine della differenza nel livello di espressione mediante la formula 2-ΔΔCt.
Anche in questo caso è stato calcolato lo scarto quadratico medio delle due reazioni, tuttavia non è stato riportato perché si tratta di campioni non deviati, ciò vuol dire che anche nel mondo non vegetale si utilizza una quantificazione relativa di un campione trattato rispetto un non trattato

Taylor e gene reference

l'utilizzo dei reference genes è un approccio comune nell'analisi dei geni per normalizzare e confrontare i livelli di espressione tra campioni diversi. L'identificazione dei reference genes stabili richiede l'uso di metodi statistici per valutare l'espressione genica in diversi contesti sperimentali

Quando si utilizzano due o più geni di riferimento, è possibile che ci siano delle differenze di espressione tra di essi. Per evitare che queste differenze influenzino in modo significativo la normalizzazione del gene target, si utilizza la media geometrica per tenerne conto.


Per calcolare la media geometrica, si moltiplicano i valori dei geni di riferimento insieme e si eleva il risultato alla potenza dell'inverso del numero totale dei geni di riferimento considerati. Ad esempio, se si utilizzano due geni di riferimento (gene A e gene B), si moltiplicano i loro valori insieme e si eleva il risultato a 1/2 (poiché ci sono due geni di riferimento).

devono essere fatti almeno tre esperimenti indipendenti bisogna fare tre estrazioni indipendenti di RNA; per ogni estrazione bisogna poi fare tre repliche tecniche di Real-Time

repliche tecniche → repliche strumentali effettuate sullo stesso campione

repliche biologiche → esperimenti indipendenti, effettuati partendo da materiale biologico (e quindi individui) diversi.

fonti di variabilità

repliche biologiche → esperimenti indipendenti, effettuati partendo da materiale biologico (e quindi individui) diversi.

estrazione → all’interno della stessa replica biologica, possono essere propagati errori in maniera diversa durante le estrazioni

retrotrascrizione → anche se le reazioni di retrotrascrizione funzionano sempre nello stesso modo, si possono avere differenze nell'efficienza

amplificazione → l’errore propagato in maniera lineare nelle fasi precedenti, a questo punto viene propagato in maniera esponenziale

per l’efficienza, è importante scegliere e primers che siano ottimali.
É vero che l’efficienza dipende anche da tutti gli step affrontati prima di arrivare al cDNA, inoltre questo non sarà puro ma in una soluzione contenente buffer di reazione, reagenti, disattivatori della retrotrascrittasi e altre e variabili;
normalizzando però, ciò che bisogna considerare è solo l’efficienza dei primers e la quantità di DNA.


L’efficienza è descritta dalla


formula N(n)= N(0)(1 + E)^n,


derivata dalla reazione di PCR.
Se si utilizzano due coppie di primers con un’efficienza diversa, la reazione di PCR porta ad un’amplificazione di questa differenza
(Es: per una coppia E=0.9, per l’altra E=0.8; in seguito all’amplificazione, la differenza di 0.1 viene propagata in modo esponenziale aumentando di un ordine di grandezza

come calcolare l'efficienza:


  • progettare una coppia di primers


  • estrarre il cDNA completo


  • pulirlo e quantificarlo, il cDNA dev'essere diluito fino ad arrivare ad una diluizione 1:4


  • si effettuano le qRT-PCR sui campioni diluiti.



i primers sono ottimali quando riescono ad amplificare anche concentrazioni molto diluite di cDNA
; i Ct ottenuti devono cadere sulla retta che descrive l’efficienza di amplificazione, ottenuta dal logaritmo della formula N(n)= N(0)(1 + E)n.

il cDNA può essere quantificato anche in modo assoluto, oltre al SYBR Green si possono usare anche altre molecole che legano in maniera specifica l’amplicone, bisogna quindi usare primers più elaborati che portano un fluoroforo in coda al 3’, questo fa un “quencing” nel momento in cui viene prodotto l’amplicone (le due molecole segnale ai 3’ dei primers vanno incontro a fusione, producendo fluorescenza).
Sarà necessario costruire una curva di quantificazione diluendo il campione e costruendo una curva standard, su questa retta di taratura (con formula pari al logaritmo di N(n)= N(0)(1 + E)n) verranno poi riportati i Ct dei campioni

SISTEMI DI RILEVAZIONI USATI IN UNA REAZIONE RTqPCR – FLUOROFORI

esempi

SYBR Green la molecola più usata come fluoroforo perché semplice, non specifica e utilizzabile in tutte le reazioni per andare a vedere qualsiasi amplicone.

Non è specifico,
si intercala nella molecola di DNA a doppio filamento ed è semplice analizzare i dati perché ci permette di capire tramite le curve di melting se l’amplificazione è specifica per il nostro frammento oppure se esistono delle amplificazioni aspecifiche che sporcano la nostra reazione, e quindi il segnale di fluorescenza non è più così attendibile.

si basano tutte sul fenomeno chiamato FRET ( fluorescence resonance energy transfer: quando un fluorocromo ad alta energia è in prossimità di uno a bassa energia vi è trasferimento dal primo al secondo).

TAQMAN

si utilizzano due primer forward e reverse per l’amplificazione, progettati in modo che siano efficienti.
una sonda: che appaia all’interno del nostro amplicone.

La sonda è composta:
da un reporter ovvero un fluoroforo al 5' ad alta energia che emette fluorescenza.
fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza


un quencher al 3’ che assorbe il segnale del fluoroforo e lo spegne al 5’ quando si trova a una certa distanza dal reporter.
fluorocromo a bassa energia che maschera ls fluorescenza del reporter

funzionamento: quando la sonda non è appaiata al nostro amplicone, le due molecole si trovano vicine e il quencher assorbe il segnale del reporter spegnendolo e non abbiamo fluorescenza.

durante i cicli di PCR, la sonda appaia sull’amplicone in formazione, il quencher e il reporter si allontanano e di conseguenza il fluorocromo emette energia e quindi emette fluorescenza, non è più bloccato dal quencher.


si va a misurare è il segnale di fluorescenza che viene emesso dalla sonda.
In questo caso la polimerasi scalza la sonda e la fluorescenza rimane nella reazione ma non è intramolecolare al DNA, il fluorocromo non si intercala

caso non possiamo analizzare i nostri ampliconi mediante curva di melting perché la sonda non è intramolecolare al DNA. Si ha poi un’idrolisi della sonda e il segnale viene perso.

MOLECULAR BEACONS

questa è una sonda caratterizzata da un fluorocromo ad alta energia e da un quencher, ma presenta una forma ad uncino.
Questa è molto specifica, nel momento in cui non abbiamo il nostro amplicone questa sonda non si appaia.
Quando la temperatura si alza, il molecular beacons si denatura e va ad appaiare all’amplicone emettendo fluorescenza
. L’unica differenza dalla TaqMan è la forma ad uncino

SCORPIONS PCR PRIMERS

sonda: quencher e fluorocromo (all’uncino), fuso alla sonda un primer di innesco., un blocker
Questa sonda è molto specifica: c’è amplificazione solo nel momento in cui il primer e quindi la sonda dando segnale, quindi possiamo seguire in tempo reale la reazione di real time.

Quindi non abbiamo primer for e rev ma la stessa sonda risulta il primer di innesco, che può essere il for o il rev.
un blocker: un agente che blocca la posizione del quencher, necessario perché nel momento in cui arriva la polimerasi che partendo dall’innesco polimerizza il DNA, questa molecola viene sbloccata dalla denaturazione e dalla polimerizzazione e di conseguenza si allontanano di nuovo quencher e fluocromo e abbiamo fluorescenza.


La sonda è quindi interna al primer.

ESEMPI APPLICATIVI

articolo1
sovraespressione indicibile del gene AtABCC3ox

AtABCC3 trasportatore vacuolare che si occupa della traslocazione all’interno del vacuolo di composti chiamati fitochelatine (PCs).

FITOCHELATINE
sono peptidi che vanno a formare dei complessi con i metalli pesanti.


Tossici perché vanno a scalzare metalli invece fondamentali per alcune reazioni chimiche e pathway biochimici essenziali per lo sviluppo della cellula, come Mg, Fe ecc.
Una volta che si sono formati i complessi fitochelatine-metallo, vengono trasferiti con l’aiuto di questi trasportatori all’interno del vacuolo, un ambiente completamente confinato, così da mettere in sicurezza la cellula.

Le piante definite tolleranti proprio perché tollerano alte concentrazioni di metalli pesanti, queste fitochelatine sono prodotte in alte quantità e vanno a legare nel citosol questi metalli formando dei complessi, salvaguardando la cellula dalla loro presenza tossica.

trasportatori ABC

hanno 2 domini:

  • citosolico idrosolubile
  • menbrana

lavoro è concentrato nel valutare l’espressione di ABC3: trasportatore che fa parte di una famiglia genica, in Arabidopsis ne esistono 14 di ABCC3 (o AtABC3).

è stato visto che questo ABCC3 veniva indotto in presenza di arsenico As e cadmio Cd.
sovra esprimendo ABCC3 la pianta moriva e se veniva sovraesprimendo oppure non germinava
quindi : in quantità eccessiva risultava tossico
L’espressione costitutiva non permetta dunque di studiare il ruolo del gene nella pianta perché ne causava la morte

L’espressione costitutiva non permetta dunque di studiare il ruolo del gene nella pianta perché ne causava la morte
si è deciso di metterlo sotto un promotore inducibile

promotore inducibile
servono ad evitare che un gene venga sempre espresso a livello costitutivo;


permettono una sovraespressione alta solo in determinati momenti: in presenza dell’induttore c’è la sovraespressione del nostro gene e posso quindi andare a studiare le piante.
Questo permette anche un livello di espressione che probabilmente non è così elevato, non arrivando alla tossicità

β-estradiolo

cassetta genica
[PG10-90+ XVE(LexA+VP16+hER+TE9)]-------gen ìe resistenza---[OLexA-46+ MCS+T3A]

promotore inducibile da estrogeni

caratterizzato da XVE(è un attivatore sintetico e chimerico):


  • LexA dominio di binding al DNA di LexA


  • VP16 dominio di transattivazione, funziona in trans e una volta espresso va ad attivare, legandosi al promotore, la trascrizione del gene dov’è presente l’elemento di risposta caratterizzato da una regione regolata che sente gli estrogeni (ER) ( come il β-estradiolo, che non è un ormone presente in pianta)

  • hER recettore umano degli estrogeni

PG10-90 promotore forte costitutivo

Chimerico: caratterizzato da più elementi derivati da organismi diversi;
sintetico: progettato da noi.

essendo sotto un promotore forte è sempre trascritto,
ma quando diventa attivo?

Quando Il dominio VP16, sentendo il 17β-estradiolo attiva al legame di questa regione di LexA sull’operatore di LexA che si trova a valle del nostro operatore.
ho un attivatore chimerico che agisce in trans (leggermente a valle, ma all’interno della stessa cassetta genica).
In mezzo tra i due abbiamo un gene di resistenza perché ci serve selezionare le piante che hanno acquisito il nostro costrutto

secondo pezzo:

  • OLexA-46
  • MCS . MCS è un multi cloning site, dove possiamo clonare qualsiasi elemento di interesse. in questo lavoro è stato clonato ABCC3 sotto il promotore minimo 35S

Quindi abbiamo trasformato le piante con il costrutto, abbiamo clonato la nostra sequenza di cds di ABCC3 (si clona di solito solo il cds (la coding sequence) nel costrutto, no introni) e abbiamo trasformato le piante.

come selezione le piante?

1) bisogna selezionare i nostri semi in presenza dell’antibiotico a cui abbiamo dato la resistenza
2) vado a valutare l'espressione di ABCC3
3) Come dimostriamo se sono più tolleranti?(fenotipo)

2) Faccio una real time. Il western sarebbe ancora più accurato.
l’analisi è a livello di trascritto.
Quindi se in presenza di induttore noto una sovraespressione di ABCC3 nella pianta trasformata rispetto al wt, vuol dire che sono riuscita a selezionare quelle piante che esprimono±di più rispetto al wt
(+- perché tra linee diverse ci saranno valori di espressione diverse poiché il costrutto si inserisce in maniera casuale)

3) crescita delle piantine con radici più lunghe in presenza di contaminanti

una real-time effettuata su tre linee.
In queste tre linee in assenza di induttore non c’è espressione di ABCC3, la sua espressione è paragonabile a quella del wt.
In presenza dell’induttore nel wt resta molto simile, mentre è significativamente più alta l’espressione di ABCC3 nelle linee sovraesprimenti

la famiglia degli ABCC3 è costituita da 15 tipi di ABCC.
Se sono tutti molto simili probabilmente ci sono altri ABCC coinvolti, per questo il fenotipo che io osservo è leggero.


Quindi gli autori si sono chiesti: Quali altri ABCC potrebbero essere coinvolti nell’accumulo di cadmio?

Per studiarlo: in presenza di diverse concentrazioni di cadmio (da 15 a 60 µM) e avendo visto in letteratura che solo due degli altri 13 erano coinvolti nel trasporto di cadmio, sono andati a vedere se anche ABCC1 e ABCC2 sono più o meno sovraespressi rispetto a ABCC3. Anche qui la tecnica usata è stata la real-time.

Questi due geni rispetto ad abcc3 nel wt effettivamente rispondevano, però a cc molto elevate abcc3 era quello più coinvolto


(Questo è un modo per capire se altri geni omologhi potrebbero avere le stesse funzioni del nostro gene di interesse)

Ed effettivamente hanno un ruolo, e in particolare in presenza di cc più elevate. A cc più basse sembrano tutti e tre coinvolti, maggiormente abcc1. E’ come se a cc elevate 1 e 2 smettessero di funzionare e abcc3 prendesse il sopravvento.

come faccio a valutare il ruolo di un gene?

  • con i mutanti e ne vado a osservare i livelli d'espressione

nel wt: abcc3 è elevato;

nel mutante abcc3: abcc3 non è espresso e vengono espressi gli altri due

nel mutante doppio abbcc1 e abcc2: c’è un’espressione elevatissima di abcc3 a complementare l’effetto di 1 e 2.

l’analisi di espressione delle varianti di splicing

Specie in presenza di stress abiotici, viene stimolato lo splicing alternativo.
geni che in presenza di metalli pesanti, producono delle isoforme di splicing, probabilmente perché aiutano la pianta nel processo di difesa.

caso studio
viene utilizzato in un unico step:
estrarre RNA,
faccio RT (retrotrascrizione)
real time qPCR nella stessa provetta,


posso farlo utilizzando 3/4 coppie di primer diverse, riesco ad analizzare il livello di espressione relativo di ogni variante di splicing rispetto alla forma canonica

Come? Usiamo il SYBR green, utilizziamo le melting curves - punto di melting a temperature più basse significano ampliconi più piccoli – quindi se io ho isoforme di splicing potrò amplificare zone diverse e distinguerle.

Poi farò un’analisi quantitativa, utilizzando la formula 2^(-ΔΔCt) .
Il tutto in assenza di un controllo interno, ovvero non mi serve il reference gene.
Il nostro reference, è la forma canonica stessa.
Quindi normalizzo rispetto ai primer che appaiano sulla forma canonica. Quindi il nostro wt reference gene sarà la forma canonica.

Le coppie di primer utilizzate sono state progettate per amplificare le regioni ai confini delle diverse forme di splicing.
Ad esempio, se una forma di splicing manca di un esone, le coppie di primer amplificheranno due ampliconi con ampiezze diverse.
L'amplicone corrispondente alla forma di splicing che contiene l'esone intero avrà una curva di melting spostata verso destra, mentre l'amplicone più piccolo indicherà la presenza dell'altra forma di splicing.

Per valutare la quantità relativa di ciascuna forma di splicing, è stata utilizzata una coppia di primer che amplifica la forma canonica.
Questo rapporto tra il numero di molecole della variante di splicing e il controllo (forma canonica) viene utilizzato per la normalizzazione.
Attraverso questa normalizzazione, è possibile valutare l'espressione relativa delle diverse varianti di splicing


Quando si utilizzano diverse coppie di primer all'interno della stessa reazione, è necessario che abbiano un'efficienza simile.
Pertanto, è stata applicata una formula che tiene conto delle differenze di efficienza per tutte le coppie di primer utilizzate. L'efficienza di ogni coppia di primer dipende dalla qualità del primer stesso e del cDNA utilizzato.
L'efficienza viene determinata sperimentalmente utilizzando diluizioni diverse del cDNA e costruendo una curva di calibrazione in base alle concentrazioni di cDNA note e ai corrispondenti valori di Ct.

l'efficienza è stata ricavata dal coefficiente angolare della retta

se l'efficienza dipende da come progetto i primer oligocal è un programma che mi aiuta a valutare i primer

mi da varie informazioni:

  • possibile primer dimers
  • forcine che potrebbe formare non appaiandosi al temprato in maniera ottimale
  • T° ottimale sia in soluzione con i sali che senza

Per una buona coppia di primer è richiesta una concentrazione di G e C che va dal 40 al 60% (migliore a 40%).
Quando la coppia di primer non forma strutture secondarie e ha questa composizione di GC l’efficienza che mi dovrebbe dare è del 100%, a condizione che si utilizzi un cDNA pulito.

domanda esame come progettare una coppia di primer data la sequenza

Risposta:
utilizzo i software a disposizione e poi valuto la concentrazione di G e C, le potenziali hairpin e forme secondarie che possono andare a ridurre l’efficienza.


Quindi il primer ideale non forma di hairpin e primer dimers.


È anche vero che gli hairpin si formano a basse temperature, quindi se la temperatura di melting della nostra coppia di primer è abbastanza alta e non abbiamo alternative possiamo comunque usarla ( considerazione sperimentale, comunque da testare).

Quindi su Excel: costruisco retta di taratura facendo diluizioni dello stesso DNA, le riporto sulle x e riporto i Ct che escono per le varie diluizioni. (riporto il logaritmo della diluizione; io non so il valore assoluto, so il valore relativo) e grafico. Ricavo lo slope. L’efficienza : E=[(10^(-1/SLOPE))-1*100]

nella retta che descrive la massima efficienza della coppia di primer dove i Ct sono riportati in funzione del logaritmo della concentrazione di DNA, quale deve essere il valore ottimale del coefficiente angolare?

-3.3. Oppure compreso tra -3.6 e -3-10
.

Efficienze basse 🡪 primer che non funzionano, appaiano tra loro, e quindi disturbano il segnale specifico del nostro amplicone

Efficienze troppo alte (che vanno oltre al 100%)
la reazione viene saturata, possibili cause:

  • c’è troppo DNA
  • ci sono pochi reagenti
  • ci sono degli inibitori di reazione.

Prima della real time affrontiamo una reazione di retro, e rimane tutto lì nel mix (retrotrascrittasi, tampone buffer con i Sali dove lavora la retro, qualche agente che disattiva la retro (anche se adesso non si usano più proprio per evitare compromissioni delle reazioni di real time successive; ora si usano delle retrotrascrittasi che vengono disattivate ad alte temperature a cui si conduce l’ultimo step della retro).


Quindi questi errori sono stati ormai superati, però spesso in lab succede che ho delle efficienze molto alte intorno ai 150%.


Probabilmente non ho fatto bene le diluizioni, sono partita da cDNA troppo concentrati. Per ovviare all’errore, devo escludere i valori più concentrati delle diluizioni e vedere se l’efficienza in quel caso migliora, così appuro che è un problema di DNA che va a saturare i reagenti in quei campioni in cui il cDNA non è diluito.