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PCR - Coggle Diagram

- - - - L’RNA messaggero è caratterizzato da una coda di poliA (estremità 3’) e un cap (estremità 5’), spesso utilizzati per disegnare gli inneschi;
        
        i primer piu utilizzati :
        
        voligo dT, complementare alla coda al 3’
        
        esameri randomici, che si appaiano in maniera casuale lungo l’RNA
        
        primer specifici, per amplificare una specifica regione di interesse, tuttavia questa modalità è generalmente più costosa, perciò generalmente si retrotrascrive l’intera sequenza e si amplifica in PCR con primer specifici.
    - - DNA polimerasi RNA dipendenti generalmente derivate da virus
        Inizialmente si utilizzavano trascrittasi inverse che lavoravano insieme ad RNAsi H in modo tale da idrolizzare la molecola eteroduplex DNA-RNA che si veniva a formare in seguito alla polimerizzazione, liberando così il cDNA templato.
        Attualmente si usano dei kit caratterizzati da enzimi ricombinanti, prive di RNAsi H ma che lavorano a temperature alle quali l’RNA si degrada.
        
        le più comuni sono Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) e da Avian Myeloblastoma Virus (AMV)
      - è generalmente seguita da una PCR, utilizzando primer specifici per verificare la presenza di un amplicone e quindi la riuscita della retrotrascrizione.
  - - - N(n) → numero di molecole di DNA al ciclo n
      - N(0) → numero di molecole di DNA iniziali
      - (1 + E)n → efficienza dell’amplificazione
      - La formula descrive una reazione esponenziale può essere meglio evidenziata attraverso i logaritmi
        Log N(n) = n log(1 + E) + log N(0)
    - - N(n)= N(0) 2n
        ΔCt = Ciclo1 – Ciclo2
        N(ΔCt)= N(0) 2ΔCt
      - ESEMPIO: calcolo della differenza di espressione tra due geni prima e dopo un trattamento.
        
        1) calcoloCalcolando la differenza tra Ctc e Ctt si ottiene il ΔCt.
        Nel caso del controllo, il gene (interleuchina β) esce al ciclo 29; nel caso del trattato, invece, al ciclo 18, ciò vuol dire che il trattato viene espresso di più che nel controllo, senza considerare l’efficenza di amplificazione sarà sufficiente elevare 2 a ΔCt per ottenere il valore della variazione dell’espressione
        
        calcolo:
        ΔCt = Ctc - Ctt = 29.63 -18.03 = 11.60
        Ratio = 2ΔCt = 211.60 = 3104 volte
        
        questi calcoli sono validi se controllo e trattato hanno lo stesso numero di molecole di DNA per far ciò si utilizzano reference interni ovvero geni housekeeping geni caratterizzati da un'espressione stabile e che quindi vengono espressi allo stesso modo sia nel trattato che nel controllo
        
        Se i due campioni presentano la stessa concentrazione di DNA, i reference saranno espressi allo stesso modo e usciranno allo stesso ciclo; quando ciò accade, la differenza nel livello di espressione del gene in analisi è attendibile.
        
        sei i reference non sono uguali potrebbe dipendere da concentrazioni di DNA differenti
        si risolve normalizzando = sottraendo al ΔCt calcolato a partire dai geni in analisi il ΔCt dei geni reference
        ΔCt geni reference = Ctc - Ctt
        Ratio = 2^ΔΔCt
    - - 2^-ΔCt → viene utilizzata per confrontare il livello di espressione del gene target (t) e del gene reference (r)
      - 2^-ΔΔCt → viene utilizzata nella quantificazione relativa, nella quale si comparano le concentrazioni relative di due campioni normalizzati ad un gene di riferimento. Si confronta il ΔCt di un campione trattato (t) e il ΔCt di un campione controllo (c)
    - - per l’efficienza, è importante scegliere e primers che siano ottimali.
        É vero che l’efficienza dipende anche da tutti gli step affrontati prima di arrivare al cDNA, inoltre questo non sarà puro ma in una soluzione contenente buffer di reazione, reagenti, disattivatori della retrotrascrittasi e altre e variabili;
        normalizzando però, ciò che bisogna considerare è solo l’efficienza dei primers e la quantità di DNA.
      - L’efficienza è descritta dalla
        formula N(n)= N(0)(1 + E)^n,
        derivata dalla reazione di PCR.
        Se si utilizzano due coppie di primers con un’efficienza diversa, la reazione di PCR porta ad un’amplificazione di questa differenza
        (Es: per una coppia E=0.9, per l’altra E=0.8; in seguito all’amplificazione, la differenza di 0.1 viene propagata in modo esponenziale aumentando di un ordine di grandezza
      - come calcolare l'efficienza:
        
        progettare una coppia di primers
        
        estrarre il cDNA completo
        
        pulirlo e quantificarlo, il cDNA dev'essere diluito fino ad arrivare ad una diluizione 1:4
        
        si effettuano le qRT-PCR sui campioni diluiti.
        
        i primers sono ottimali quando riescono ad amplificare anche concentrazioni molto diluite di cDNA
        ; i Ct ottenuti devono cadere sulla retta che descrive l’efficienza di amplificazione, ottenuta dal logaritmo della formula N(n)= N(0)(1 + E)n.
  - - - CHAMATA Ct
        i valori di Ct sono inversamente proporzionali alla concentrazioni iniziali dei DNA target.
      - importante:
        
        Al ciclo di threshold la fluorescenza è uguale in tutti i campioni;
        
        La real time concentra la sua analisi nella curva che esce dal threshold
        
        Il threshold viene imposto quando il segnale diventa specifico, ovvero quando la curva esce dal rumore di fondo
  - - - La reazione di Real-Time dura generalmente 40 cicli. A fine reazione è possibile introdurre una serie di step che descrivono la curva di melting, ovvero la curva che descrive la denaturazione dei prodotti.
        
        Questo è possibile grazie al SYBR Green, in quanto questo si intercala alla doppia elica, perciò maggiore sarà il numero di molecole duplex e maggiore sarà la fluorescenza.
      - La temperatura del campione viene aumentata in modo incrementale, fino ad arrivare ad un punto di flesso= Indica la temperatura di fusione
        
        temperatura di fusione T°= alla quale metà delle molecole di DNA saranno denaturate
        
        picco di melting T° fusione
        La presenza di più picchi indica la presenza di altre molecole di DNA, quindi questo metodo permette di valutare la “pulizia” della reazione e di individuare la presenza di aspecifici.
  - - - viene utilizzata per confrontare l’espressione di un gene in un mutante e in un wild-type, o in un fenotipo sovraesprimente rispetto ad un wild-type.
        L’analisi di confronto non fornisce la quantità esatta dell’amplicone ma il suo grado di espressione rispetto alla condizione wild-type.
      - si utilizza un gene reporter, questo fornisce un segnale di fondo uguale in tutti i campioni che viene sottratto al segnale specifico
        
        se si utilizzano le nuove PCR cn sistema a rotore non serve ed esse leggono il segnale simgolarmente eliminando in maniera automatica il background
- - - - t-Test per due campioni
        
        t-test unpaired quando si analizzando due gruppi indipendenti (misure provenienti da due campioni diversi)
        
        t-test paired quando si analizzando più campioni (come tre genotipi o tre condizioni diversi),
      - anova per più campioni
      - devono essere fatti almeno tre esperimenti indipendenti bisogna fare tre estrazioni indipendenti di RNA; per ogni estrazione bisogna poi fare tre repliche tecniche di Real-Time
        
        repliche tecniche → repliche strumentali effettuate sullo stesso campione
        
        repliche biologiche → esperimenti indipendenti, effettuati partendo da materiale biologico (e quindi individui) diversi.
        
        fonti di variabilità
        
        repliche biologiche → esperimenti indipendenti, effettuati partendo da materiale biologico (e quindi individui) diversi.
        
        estrazione → all’interno della stessa replica biologica, possono essere propagati errori in maniera diversa durante le estrazioni
        
        retrotrascrizione → anche se le reazioni di retrotrascrizione funzionano sempre nello stesso modo, si possono avere differenze nell'efficienza
        
        amplificazione → l’errore propagato in maniera lineare nelle fasi precedenti, a questo punto viene propagato in maniera esponenziale
    - - tra i più utilizzati del 2001
        In questo esperimento è stato visto il livello di espressione nel cervello e nei reni
        producendo più repliche sia per il gene reference (GAPDH) che per il gene target (c-myc); calcolando poi i ΔCt, il ΔΔCt ed infine della differenza nel livello di espressione mediante la formula 2-ΔΔCt.
        Anche in questo caso è stato calcolato lo scarto quadratico medio delle due reazioni, tuttavia non è stato riportato perché si tratta di campioni non deviati, ciò vuol dire che anche nel mondo non vegetale si utilizza una quantificazione relativa di un campione trattato rispetto un non trattato
    - - l'utilizzo dei reference genes è un approccio comune nell'analisi dei geni per normalizzare e confrontare i livelli di espressione tra campioni diversi. L'identificazione dei reference genes stabili richiede l'uso di metodi statistici per valutare l'espressione genica in diversi contesti sperimentali
      - Quando si utilizzano due o più geni di riferimento, è possibile che ci siano delle differenze di espressione tra di essi. Per evitare che queste differenze influenzino in modo significativo la normalizzazione del gene target, si utilizza la media geometrica per tenerne conto.
        Per calcolare la media geometrica, si moltiplicano i valori dei geni di riferimento insieme e si eleva il risultato alla potenza dell'inverso del numero totale dei geni di riferimento considerati. Ad esempio, se si utilizzano due geni di riferimento (gene A e gene B), si moltiplicano i loro valori insieme e si eleva il risultato a 1/2 (poiché ci sono due geni di riferimento).
- - - - Non è specifico,
        si intercala nella molecola di DNA a doppio filamento ed è semplice analizzare i dati perché ci permette di capire tramite le curve di melting se l’amplificazione è specifica per il nostro frammento oppure se esistono delle amplificazioni aspecifiche che sporcano la nostra reazione, e quindi il segnale di fluorescenza non è più così attendibile.
    - - TAQMAN
        
        si utilizzano due primer forward e reverse per l’amplificazione, progettati in modo che siano efficienti.
        una sonda: che appaia all’interno del nostro amplicone.
        
        durante i cicli di PCR, la sonda appaia sull’amplicone in formazione, il quencher e il reporter si allontanano e di conseguenza il fluorocromo emette energia e quindi emette fluorescenza, non è più bloccato dal quencher.
        si va a misurare è il segnale di fluorescenza che viene emesso dalla sonda.
        In questo caso la polimerasi scalza la sonda e la fluorescenza rimane nella reazione ma non è intramolecolare al DNA, il fluorocromo non si intercala
        
        caso non possiamo analizzare i nostri ampliconi mediante curva di melting perché la sonda non è intramolecolare al DNA. Si ha poi un’idrolisi della sonda e il segnale viene perso.
        
        La sonda è composta:
        da un reporter ovvero un fluoroforo al 5' ad alta energia che emette fluorescenza.
        fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza
        un quencher al 3’ che assorbe il segnale del fluoroforo e lo spegne al 5’ quando si trova a una certa distanza dal reporter.
        fluorocromo a bassa energia che maschera ls fluorescenza del reporter
        
        funzionamento: quando la sonda non è appaiata al nostro amplicone, le due molecole si trovano vicine e il quencher assorbe il segnale del reporter spegnendolo e non abbiamo fluorescenza.
      - MOLECULAR BEACONS
        
        questa è una sonda caratterizzata da un fluorocromo ad alta energia e da un quencher, ma presenta una forma ad uncino.
        Questa è molto specifica, nel momento in cui non abbiamo il nostro amplicone questa sonda non si appaia.
        Quando la temperatura si alza, il molecular beacons si denatura e va ad appaiare all’amplicone emettendo fluorescenza
        . L’unica differenza dalla TaqMan è la forma ad uncino
      - SCORPIONS PCR PRIMERS
        
        sonda: quencher e fluorocromo (all’uncino), fuso alla sonda un primer di innesco., un blocker
        Questa sonda è molto specifica: c’è amplificazione solo nel momento in cui il primer e quindi la sonda dando segnale, quindi possiamo seguire in tempo reale la reazione di real time.
        
        Quindi non abbiamo primer for e rev ma la stessa sonda risulta il primer di innesco, che può essere il for o il rev.
        un blocker: un agente che blocca la posizione del quencher, necessario perché nel momento in cui arriva la polimerasi che partendo dall’innesco polimerizza il DNA, questa molecola viene sbloccata dalla denaturazione e dalla polimerizzazione e di conseguenza si allontanano di nuovo quencher e fluocromo e abbiamo fluorescenza.
        La sonda è quindi interna al primer.
  - - - AtABCC3 trasportatore vacuolare che si occupa della traslocazione all’interno del vacuolo di composti chiamati fitochelatine (PCs).
        
        FITOCHELATINE
        sono peptidi che vanno a formare dei complessi con i metalli pesanti.
        Tossici perché vanno a scalzare metalli invece fondamentali per alcune reazioni chimiche e pathway biochimici essenziali per lo sviluppo della cellula, come Mg, Fe ecc.
        Una volta che si sono formati i complessi fitochelatine-metallo, vengono trasferiti con l’aiuto di questi trasportatori all’interno del vacuolo, un ambiente completamente confinato, così da mettere in sicurezza la cellula.
        
        Le piante definite tolleranti proprio perché tollerano alte concentrazioni di metalli pesanti, queste fitochelatine sono prodotte in alte quantità e vanno a legare nel citosol questi metalli formando dei complessi, salvaguardando la cellula dalla loro presenza tossica.
        
        trasportatori ABC
        
        hanno 2 domini:
        
        citosolico idrosolubile
        
        menbrana
        
        la famiglia degli ABCC3 è costituita da 15 tipi di ABCC.
        Se sono tutti molto simili probabilmente ci sono altri ABCC coinvolti, per questo il fenotipo che io osservo è leggero.
        Quindi gli autori si sono chiesti: Quali altri ABCC potrebbero essere coinvolti nell’accumulo di cadmio?
        
        Per studiarlo: in presenza di diverse concentrazioni di cadmio (da 15 a 60 µM) e avendo visto in letteratura che solo due degli altri 13 erano coinvolti nel trasporto di cadmio, sono andati a vedere se anche ABCC1 e ABCC2 sono più o meno sovraespressi rispetto a ABCC3. Anche qui la tecnica usata è stata la real-time.
        
        Questi due geni rispetto ad abcc3 nel wt effettivamente rispondevano, però a cc molto elevate abcc3 era quello più coinvolto
        (Questo è un modo per capire se altri geni omologhi potrebbero avere le stesse funzioni del nostro gene di interesse)
        
        Ed effettivamente hanno un ruolo, e in particolare in presenza di cc più elevate. A cc più basse sembrano tutti e tre coinvolti, maggiormente abcc1. E’ come se a cc elevate 1 e 2 smettessero di funzionare e abcc3 prendesse il sopravvento.
        
        come faccio a valutare il ruolo di un gene?
        
        con i mutanti e ne vado a osservare i livelli d'espressione
        
        nel wt: abcc3 è elevato;
        
        nel mutante abcc3: abcc3 non è espresso e vengono espressi gli altri due
        
        nel mutante doppio abbcc1 e abcc2: c’è un’espressione elevatissima di abcc3 a complementare l’effetto di 1 e 2.
        
        lavoro è concentrato nel valutare l’espressione di ABC3: trasportatore che fa parte di una famiglia genica, in Arabidopsis ne esistono 14 di ABCC3 (o AtABC3).
        
        è stato visto che questo ABCC3 veniva indotto in presenza di arsenico As e cadmio Cd.
        sovra esprimendo ABCC3 la pianta moriva e se veniva sovraesprimendo oppure non germinava
        quindi : in quantità eccessiva risultava tossico
        L’espressione costitutiva non permetta dunque di studiare il ruolo del gene nella pianta perché ne causava la morte
        
        L’espressione costitutiva non permetta dunque di studiare il ruolo del gene nella pianta perché ne causava la morte
        si è deciso di metterlo sotto un promotore inducibile
        
        promotore inducibile
        servono ad evitare che un gene venga sempre espresso a livello costitutivo;
        permettono una sovraespressione alta solo in determinati momenti: in presenza dell’induttore c’è la sovraespressione del nostro gene e posso quindi andare a studiare le piante.
        Questo permette anche un livello di espressione che probabilmente non è così elevato, non arrivando alla tossicità
        
        β-estradiolo
        
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    - - Specie in presenza di stress abiotici, viene stimolato lo splicing alternativo.
        geni che in presenza di metalli pesanti, producono delle isoforme di splicing, probabilmente perché aiutano la pianta nel processo di difesa.
      - caso studio
        viene utilizzato in un unico step:
        estrarre RNA,
        faccio RT (retrotrascrizione)
        real time qPCR nella stessa provetta,
        posso farlo utilizzando 3/4 coppie di primer diverse, riesco ad analizzare il livello di espressione relativo di ogni variante di splicing rispetto alla forma canonica
        
        Come? Usiamo il SYBR green, utilizziamo le melting curves - punto di melting a temperature più basse significano ampliconi più piccoli – quindi se io ho isoforme di splicing potrò amplificare zone diverse e distinguerle.
        
        Poi farò un’analisi quantitativa, utilizzando la formula 2^(-ΔΔCt) .
        Il tutto in assenza di un controllo interno, ovvero non mi serve il reference gene.
        Il nostro reference, è la forma canonica stessa.
        Quindi normalizzo rispetto ai primer che appaiano sulla forma canonica. Quindi il nostro wt reference gene sarà la forma canonica.
        
        Le coppie di primer utilizzate sono state progettate per amplificare le regioni ai confini delle diverse forme di splicing.
        Ad esempio, se una forma di splicing manca di un esone, le coppie di primer amplificheranno due ampliconi con ampiezze diverse.
        L'amplicone corrispondente alla forma di splicing che contiene l'esone intero avrà una curva di melting spostata verso destra, mentre l'amplicone più piccolo indicherà la presenza dell'altra forma di splicing.
        
        Per valutare la quantità relativa di ciascuna forma di splicing, è stata utilizzata una coppia di primer che amplifica la forma canonica.
        Questo rapporto tra il numero di molecole della variante di splicing e il controllo (forma canonica) viene utilizzato per la normalizzazione.
        Attraverso questa normalizzazione, è possibile valutare l'espressione relativa delle diverse varianti di splicing
        
        Quando si utilizzano diverse coppie di primer all'interno della stessa reazione, è necessario che abbiano un'efficienza simile.
        Pertanto, è stata applicata una formula che tiene conto delle differenze di efficienza per tutte le coppie di primer utilizzate. L'efficienza di ogni coppia di primer dipende dalla qualità del primer stesso e del cDNA utilizzato.
        L'efficienza viene determinata sperimentalmente utilizzando diluizioni diverse del cDNA e costruendo una curva di calibrazione in base alle concentrazioni di cDNA note e ai corrispondenti valori di Ct.
        
        l'efficienza è stata ricavata dal coefficiente angolare della retta
        
        se l'efficienza dipende da come progetto i primer oligocal è un programma che mi aiuta a valutare i primer
        
        mi da varie informazioni:
        
        possibile primer dimers
        
        forcine che potrebbe formare non appaiandosi al temprato in maniera ottimale
        
        T° ottimale sia in soluzione con i sali che senza
        
        Per una buona coppia di primer è richiesta una concentrazione di G e C che va dal 40 al 60% (migliore a 40%).
        Quando la coppia di primer non forma strutture secondarie e ha questa composizione di GC l’efficienza che mi dovrebbe dare è del 100%, a condizione che si utilizzi un cDNA pulito.
        
        domanda esame come progettare una coppia di primer data la sequenza
        
        Risposta:
        utilizzo i software a disposizione e poi valuto la concentrazione di G e C, le potenziali hairpin e forme secondarie che possono andare a ridurre l’efficienza.
        Quindi il primer ideale non forma di hairpin e primer dimers.
        È anche vero che gli hairpin si formano a basse temperature, quindi se la temperatura di melting della nostra coppia di primer è abbastanza alta e non abbiamo alternative possiamo comunque usarla ( considerazione sperimentale, comunque da testare).
        
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        nella retta che descrive la massima efficienza della coppia di primer dove i Ct sono riportati in funzione del logaritmo della concentrazione di DNA, quale deve essere il valore ottimale del coefficiente angolare?
        
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