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APPROCCI DI BIOLOGIA TRASLAZIONALE PER AUMENTARE LA PRODUTTIVITA’ DELLA…

- - - - fattori esterni:
        
        Fotoperiodo =luce/ buio nei climi temperati le giornate si allungano.
        
        Vernalizzazione: prolungato tempo al freddo ci porta l’esempio dei tulipani (non è valido per tutte le piante. La pianta deve sopravvivere all’inverno nello stato vegetativo
        
        Temperatura ambientali: es anche se c’è un giorno breve (periodo di luce) ma temperature sono alte alte la pianta è indotta a fiorire. Su quetso fattore influisce il cambiamento climatico
      - fattori endogeni
        
        Ormoni: citochine e ghiberelline
        Ciclo circadiano
        Zuccheri patway
        Invecchiamento: la pianta sa quanto sta invecchiando
- - - - figura B è un ingrandimento di un gene SOC1 dove vedo le “cunette verdi” è li che si lega il fattore trascrizionale.
        Quest’informazione l’ottengo sequenziando il DNA legato vedo tutte le regioni legate (ribs) e riappaiono sul genoma
      - Le informazioni ottenute sul genoma lo compatto (figura A) e vado a vedere dove sono e quanti sono i picchi
        
        Analisi dettagliata di un promotore del gene che mi aiuta a vedere nel dettaglio dove sono siti ricchi di legami con proteine chiamate biofattori di trascrizione.
        Quello che posso cercare è il “motivo” di FD ovvero la sequenza di DNA presente in cui FD si lega di più e lo posso usare per cercare la sequenza simile in genomi di altre specie
      - Per capire se FD ha una funzione oppure no vado a vedere come si esprime quel gene FIGURE C
        Le righe ci indicano i livelli d’espressione in 11LD (non c’è stata transizione) 15LD (c’è la transizione) possiamo quindi vedere i livelli d’espressione di questi geni e mi permette di confrontarli
- - - - Creare una pianta con 5 mutani non è semplice!
        In ogni pianta posso introdurre un solo mutante per volta e selezionare la singola pianta. Con la CRISP farei molto più velocemente.
        Ottenere una pianta con queste caratteristiche mi permetterebbe di avere una costanza nella produzione
  - - - Rucola: si mangiano le foglie, è una pianta che cresce bene in Italia, ma molte sementi sono olandesi
      - -Come faccio a non far fiorire/ ritardare la fioritura?-
        Mi serve della variazione genetica. Legalmente posso usare la MUTAGENESI CHIMICA capace di introdurre mutazioni puntiformi casuali e poi mi selezioni i tratti d’interesse.
        
        MUTAGENESI CHIMICA
        
        Come lo faccio?
        Uso EMS ethyl methanesulfonate che causa mutazioni puntiformi del genoma (SNP), va utilizzato in ambienti controllati.
        Alcune di queste mutazioni non hanno effetto
        
        nella pratica:
        1) tratto i semi
        2) cresco la 1° generazione 1 si autofeconda
        3) da origine a M2 in cui osservo i fenotipi che possiamo andare a stabilizzare.
        se osservo il fenotipo d'interesse posso andare a cercarmi il gene che lo causa
        
        Esempio ho una pianta che sembra avere un ritardo nella fioritura vado a capire se la mutazione e legata a FD.
        Io so che FD lega SOC1 e quindi pensare che il gene SOC1 sia importante quindi vado a crearmi un mutante di SOC1 per vedere qual è il fenotipo.
        
        Oppure io posso usare il genotipo solo se ho dei geni candidati quindi una volta trovati i geni candidati andare a vedere cosa succede al fenotipo
        
        Si tratta di una metodologia interessante so quale gene da la resistenza al verticilium lo vado a modificare e vedo se effettivamente funziona prendendo la mia popolazione mettendoci sopra il verticilium e vedo chi sopravvive
        
        per fare un approccio del genere devo avere delle conoscenze approfondite del genoma se non le ho mi conviene andare a vedere in campo.
        
        e se il genoma non c'e lho?
        
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        Sono andati a vedere e categorizzare i beans (sono pezzi di cromosoma) e poi vado a contare quanti polimorfismi ho ottenuto e con i colori evidenzio la quantità di mutazioni (ROSSO valori piu alti)
        Con questa tecnica creo tantissimi polimorfismi
        (immagine)
    - - La strategia si chiama TILLING dalla popolazione io estrarre il DNA mi disegno il primer e vado a vedere se ci sono mutazioni in quei pezzi di DNA
      - Riassunto della tecnica:
        1) tratto i semi
        2) metto in campo
        3) cresco ed estraggo il DNA e vado a cercare se qualcuna di queste piante ha la mutazione di mio interesse
        4) se trovo la mutazione che mi interessa vado a vede il fenotipo in M3 e M4
        
        Per sequenziare non sequenzio una singola pianta ma creo dei pool i campioni che raccolgo i miei campioni impilati ma posso impilare le mie piastre e mischiare i DNA in x,y,z creo cosi dei pool e cosi faccio meno PCR e dai risultati di dove si presenterà la mutazione posso risalire al campione di appartenenza
    - - L’altra opzione è io non ho idea di cosa devo cercare per esempio io voglio ottenere una foglia più frastagliata ma non conosco il gene che regola questa cosa ma posso osservarne il fenotipo
      - 1) Quindi faccio il trattamento
        2) semino e in campo vado a selezionare per fenotipo (io potrei fermarmi qui) se però voglio approfondire la mia conoscenze è capire qual è il gene che è modificato in quella pianta.
        Si fa la BULK SEGREGANT analysis ovvero faccio l’incrocio tra la mia pianta selezionata da fenotipo con WT la generazione che ottengo è chiamata backcross BC1F1. Se faccio crescere un’altra generazione (e se il gene mutato è uno solo) farà una segregazione medeliana 1:3( una con la mutazione)
        
        Se ne semino piante e vado a prendere solo il fenotipo che mi interessa faccio un estrazione di DNA e sequenzio otterrò un grafico di questo tipo 
        La spiegazione è se la mutazione è legata al mio carattere tutte le piante che hanno quel fenotipo avranno quella mutazione, tutti gli altri SNP che ho introdotto saranno casuali noi dobbiamo trovare il comune denominatore.
        
        Nell’immagine osservo i 5 cromosomi con la frequenza allelica se i puntini rossi si trovano a metà del grafico la mutazione non è associata è random.
        Se la mutazione è dovuta a quel locus esaminato dovrà esser presente nel 100% delle piante vedi Chr5.
        Poi vado a vedere le tabelle con tutti gli snp e quello che osservo è il cromosoma 5 vado a vedere la posizione R =reference M= mutazione il tipo di mutazione es non-sinonimo mi converte gli amminoacidi es da G a S nel terzo caso da arginina diventa uno stop coding.
        La AF frequenza allelica quelli con 1 sono i più interessanti.
        Questo mi permette di dire che il fenotipo è associato a uno di questi 3 geni
- - - - Quindi vado a studiare in arabidopsi e vado a vedere dei mutanti che sono molto vicini a quello che vogliamo ottenere in cima di rapa.
        In questo caso sono mutanti del pathway delle giberelline quando ne producono meno i fiori escono un po’ diversi che sono come quelli che desidero avere nella cima di rapa
        
        Ho a disposizione un’informazione le gibberelline vengono inibite dal paclobutrazolo PAC.
        Quindi se io tratto con la PAC (si scioglie in etanolo) le infiorescenze riesco a cambiarle (approccio farmacologico).
        La MOCK è stessi ingredienti tranne il PA (soluzione controllo).
        
        alla fine ha funzionato?
        Si c’è stato un effettivo ritardo nella apertura dei fiori, ma come possiamo osservare questo ha influito anche sulla forma della pianta.
        Perché?
        Perché le gibberelline nella pianta non si occupano solo della antesi dei fiori fanno un po’ di tutto regolano la crescita cellulare es alterazione nell’altezza del riso e del grano.
        
        Questo vuol dire che il PAC va spruzzato al momento giusto
        Ora il PAC io non lo posso spruzzare su una pianta da vendere però questa ricerca
        cosa mi ha lasciato?
        ora so che se deregolo i patway delle giberelline posso influire sull’antesi del fiore e che potrei quindi potrei andare a vedere se esistono in natura di mutanti di questo patway
  - - - Identificato il locus se troviamo una mutazione che ha un effetto sulla proteina solo le più interessanti.
        
        A questo punto io posso utilizzare delle varietà già esistenti ed inserire la mutazione nella pianta che io coltivo
        
        È quello che fa un’azienda di breeding:
        usa dei genotipi selvatici in programmi di miglioramento.
        Le varietà elitè che hanno già una serie di tratti d’interesse.
        Nella pianta d’interesse io voglio introdurre un solo tratto nella pianta e il resto deve rimanere bello com’era prima
        . Quindi si fanno le introgressioni dei tratti.
        Ho la mia pianta con la mutazione delle gibberelline e ho la pianta che contivo da sempre io devo spostare solo il tratto d’interesse.
        Quindi faccio per prima cpoa un incrocio e contino a rincrociare nella mia varietà commerciale in questo mod io mantengo il più possibile il DNA della mia pianta originale ma con la mutazione d’interesse