LEGISLAZIONE
NUOVE TECNICHE GENOMICHE NGT

SVILUPPI NELLA COMUNITA' EUROPEA

1) Nel 2018 la Corte di Giustizia europea stabilisce che i prodotti dell’editing sono OGM e rientrano nella legislazione preesistente sugli OGM.


2) Nel 2022 la Commissione europea ha lanciato una consultazione pubblica, aperta a tutti, con lo scopo di sentire più voci sul tema. Una prima consultazione di un mese in cui si potevano inviare dei commenti; la seconda riguardava la compilazione di questionari che sono stati raccomandati dai Ministeri. La consultazione è terminata nel luglio 2022. Il risultato faceva chiaramente notare che c’era un’incertezza legata proprio alla Direttiva del 2001 sugli OGM. I requisiti e i controlli stabiliti da questa Direttiva del 2001 non sono adeguati ai profili di rischio di questi prodotti e che la legislazione imponeva quindi dei problemi di adozione di questi prodotti.


3) aperta una nuova consultazione adesso

Il primo report è stato prodotto dall’EFSA, sulla valutazione del rischio dei prodotti ottenuti con le nuove tecniche genomiche (NTG).


In realtà questo documento non nasce da una nuova valutazione del rischio fatta da EFSA.


L’EFSA aveva fatto negli anni precedenti diverse valutazioni ( in particolare c’è il documento del 2012)ha fatto diverse valutazioni: la valutazione del rischio dei prodotti ottenuti per gli SDN1, per gli SDN2, per gli SDN3 e per la cis-genesi.


Per cui semplicemente sono stati rivalutati tutti i documenti già prodotti e tutto ciò che era stato pubblicato in quel lasso di tempo dai ricercatori.

Il secondo report che ricorda quello che è lo stato dell’arte dei prodotti ottenibili tramite NGT. Questo è stato prodotto dal laboratorio di riferimento europeo per gli OGM che si trova ad Istraa.

Un terzo report prodotto da un gruppo di lavoro della Commissione che ha riportato le applicazioni attuali e future ottenibili tramite le tecniche del genome editing. Questo affronta anche la questione etica

Questo documento che invece verrà sostituito a breve che parla dei metodi di detection di questi prodotti ottenuti tramite NGT.


Infatti la Commissione ha chiesto di redigere un documento sulle problematiche relative a questi prodotti.


Il risultato è stato che la singola mutazione di una singola base che può essere modificata si può anche rilevare, MA non potrai mai capire se quel prodotto è stato ottenuto naturalmente, o con le tecniche di breeding classico o con il genome editing.


Quindi questo è un problema per il controllo ufficiale

Quindi il problema è come la traccio? Come faccio il controllo ufficiale? è praticamente impossibile

DEFINIZIONI E TERMINOLOGIA

La nucleasi taglia la doppia elica. Le nuove tecnologie affinano questo metodo con il prime editing

  • SDN-1: quando in seguito al taglio il sistema di riparazione del DNA interviene non utilizzando la strategia della ricombinazione omologa.



    per cui si riattaccano i filamenti e accade di solito che si perde una base, e ciò provoca interruzione genica→ knock out.


    E’ la tipologia più usata per questo tipo di prodotti perchè non rimane DNA esogeno nella pianta, disattivo un gene che di solito è un regolatore negativo che è meglio eliminare

SDN-2:
avviene ricombinazione, corregge un allele con un altro allele che però ha delle piccole differenze di sequenza

SDN-3:
si inserisce un ampio frammento tramite ricombinazione omologa. Come se si producesse un OGM ma inserendolo in una regione per precisa.

New Genomic Techniques (NGTs):
Quando parliamo di nuove tecniche genomiche parliamo di tutte quelle tecniche che sono state sviluppate dopo la pubblicazione della Direttiva 2001/18/CE (quella sugli OGM). Le tecniche sviluppate dopo sono quindi le NGT

Gene Editing (ISO DIS 5058-1)
: un gruppo di nuove tecniche di mutagenesi mirata che facilitano l'aggiunta, la rimozione o l'alterazione di sequenze di DNA in un punto specifico del genoma; genera diversi tipi di alterazioni nel genoma, che vanno da variazioni di singoli nucleotidi (SNV), a delezioni e inserzioni di molte coppie di basi.

Le ISO sono delle classificazioni fatte e riconosciute a livello internazionale. Sono delle norme e metodi analitici che vengono sviluppati e poi adottati nei laboratori, fungendo da riferimenti condivisi a livello internazionale.

Targeted mutagenesis
è un termine generico utilizzato per descrivere le nuove tecniche di mutagenesi che inducono mutazioni in punti selezionati del genoma senza inserire materiale genetico (può essere inserito in una fase intermedia ma nel prodotto finale non deve esserci).


Il processo si traduce solitamente in un «knock-out» del gene responsabile di un effetto indesiderato, oppure in modifiche della proteina espressa o di elementi regolatori di un gene (EC, 2021).

In alcuni Paesi in cui il genome editing è utilizzato con una certa facilità e alcuni prodotti sono già stati commercializzati, l’importante è non ci sia DNA esterno.
Quindi fondamentalmente si punta sulla SDN1 che generalmente genera il knock out di un gene oppure sulla cis-genesi, in cui si inserisce un gene già presente in quella specie oppure modifico solo una parte di quel gene con un altro gene identico che però non funziona bene, cosa che posso fare anche tramite incroci però mi richiede poi anni per raggiungere il fenotipo desiderato.

la mutagenesi inserzionali si ottengono tramite trasfezione o trasformazione incorporando pezzi più grandi di DNA e che sono estranei, che non fanno parte del gene pool del breeding. sono facilmente identificabili perchè contengono promotori e terminatori.

Un’altra cosa importante nella detection di questi prodotti è che non essendoci marcatori non posso utilizzare i metodi di screening che semplificano molto il lavoro. Con questi prodotti non esistono metodi di screening.

SDN3 prrla la cis-genesi o la intra-genesi, perchè quello che sta affrontando adesso la Commissione europea che corrisponde ai prodotti che si sono ottenuti in questi ultimi anni fondamentalmente sono prodotti che si ottengono con l’SDN1, con l’SDN2 o con l’SDN3 però in genere si tratta di cis genesi o intragenesi.


Quindi alla Commissione è stato chiesto proprio di valutare la sicurezza d’uso e di cercare di modificare la Normativa attuale tenendo conto della mutagenesi sito specifica diretta (quindi prodotti ottenuti con una precisione chirurgica) e la cis genesi ( quindi prodotti che si ottengono sostitendo geni già presenti nella stessa specie oppure con geni presi da una specie sessualmente compatibile).

criteri per la valutazione del rischio UE

Primo step: all’interno del mio prodotto c’è una sequenza di DNA esogeno?



Se è NO è una pianta editata (potrebbe anche essere una pianta normale ma in questo caso so che è stata modificata) e passa al Criterio 5 e 6

Se è SI, quindi è presente un DNA esterno passo al Criterio 2:

Criterio 2: Questo DNA fa parte del gene pool dei breeders?

NO→ pianta transgenica

SI→ può essere un cis gene o un intragene e passiamo quindi al Criterio 3

Criterio 3 considerando importante il tipo di integrazione: L’integrazione è random o va a inserirsi in un punto ben preciso (safe harbour targeting via SDN-3)?

Se c’è un safe harbour site allora si passa ai criteri 5 e 6 che devono essere soddisfatti per dire che non è un OGM. Se

Se invece è random passiamo al Criterio 4

Criterio 4 verificando se c’è stata un’interruzione del gene endogeno nelle vicinanze.

Se non c’è stata → Criteri 5 e 6.

Se c’è stata dobbiamo andare a fare una Valutazione del rischio, ossia vedere se il gene interrotto crea problemi oppure no.

Se non c’è rischio → criteri 5 e 6.

Se si identifica un rischio si andrà a fare una valutazione del rischio classica, quella che si fa solitamente per gli OGM

la possibilità di effetti off-target anche nelle SDN-1.


Nel caso in cui all’interno di quel genoma siano stati introdotti tantissime mutazioni contemporaneamente. Quindi in modo generico dire che se si tratta di una SDN-1 siamo tranquilli non è sempre vero, perchè ci possono essere degli off-target.

In seguito al Decision Tree riportato prima, la Commissione europea sulle biotecnologie ha proposto tre criteri per dire che c’è equivalenza tra il prodotto di genome editing e il prodotto ottenuto con il breeding naturale oppure già esistente in natura.
Quindi hanno proposto tre criteri, che non fa vedere, perchè non sono cose ancora ufficiali e non sono ancora stati decisi.


Il fine è quello di semplificare la cosa quindi ad esempio dire che se le inserzioni sono limitate nel numero di nucleotidi allora possiamo stare sicuri e le delezioni possono anche essere ampie.


Questa cosa non è chiarissima e ad esempio l’Italia ha fatto osservare la necessità di fissare un limite per definire una inserzione limitata. Equivalenza non significa sicurezza. La Commissione deve cercare di bilanciare le diverse posizioni degli stati membri per redigere un documento da portare poi in Parlamento per essere votato.

arrivati al criterio 5 possiamo avere diverse situazioni:

  • piante in cui non è presente DNA esterno;
  • cis o intra genesi integrati in modo preciso;
  • cis o intergenesi random senza interruzione di geni endogeni
  • cis o intagrenici con interruzione di gene enodgeno ma senza al cun rischio identificato.

Il Criterio 5 consiste nella storia di sicurezza d’uso, nella familiarità del caso dell’ambiente e della una valutazione complessiva caso per caso.


Che si intende per storia di sicurezza d’uso in un prodotto nuovo?


Storia di sicurezza d’uso significa che quel prodotto è stato utilizzato per molte generazioni senza creare problemi,


per i prodotti nuovi si fa così:

  • si cerca nella pianta che ha donato il gene se questa pianta è stata utilizzata come cibo per l’uomo o per gli animali per un certo periodo di anni.

La stessa cosa per la familiarità che si usa invece per l’ambiente

  • se la pianta da cui deriva il gene che è stato trasferito è presente nell’ambiente da tanti anni si dice che c’è storia di familiarità

e se non posso dimostrare nè la storia di sicurezza d’uso nè la familiarità? ,

l Criterio 6
vado a valutare la funzione e la struttura dell’allele che è stato inserito.


Quindi valuto se la funzione iniziale che l’allele aveva in un’altra pianta è stata conservata oppure no, se sono state aggiunte nuove funzioni, se questo nuovo allele ha generato dei prodotti tossici o allergenici, se il livello e la specificità di tessuto dell’espressione del nuovo allele è conservata o non è più comparabile.


E IN ITALIA COSA SI FA CON IL GENOME EDITING?

l’unico progetto finanziato dal Ministero dell’Agricoltura per l’applicazione della cis genesi e del genome editing a piante coltivate.
Lo scopo era quello di favorire l’acquisizione di conoscenza sulle funzione dei geni, sviluppare nuovi genotipi e promuovere la diffusione di queste nuove tecniche nella comunità scientifica.


Tutti questi studi sono stati fatti in laboratorio e non si è passati alla prova in campo
Alcuni dei risultati ottenuti dalle principali linee di ricerca comprendono: melanzane senza semi, piante di pomodoro in grado di inibire la germinazione di alcune erbe infestanti, piantine di kiwi che contengono mutazioni su geni coinvolti nel controllo della suscettibilità batterica, linee di pomodoro resistenti allo stress idrico.

In fase di completamento:
piante cisgeniche e editate per migliorare la resistenza agli stress biotici (in particolare Oidio e Peronospora in vite, fuoco batterico in melo e pero, batteriosi in kiwi, Peronospora in basilico dolce); miglioramento della qualità ( accumulo di metaboliti secondari in pomodoro e arancio dolce, riduzione delle dimensioni dei semi in arancia dolce e pompelmo, riduzione dell'imbrunimento nelle melanzane fresche) o miglioramento caratteristiche agronomiche (dimensioni dei semi nel grano duro, autocompatibilità nella pera, fioritura precoce nell'arancia dolce, fragole rifiorenti).

fa miglioramento biotecnologico se ne occupa è l’ENEA

diversi gruppi di ricerca continuano a farlo utilizzando biotecnologie innovative:

  • Sono state generate piante di patata tetraploidi prive di transgeni (cv. Desiree) in cui il gene eIF4E-1, responsabile dell'interazione con la proteina VpG del potyvirus, è stato inattivato da Cas9. Attualmente, in collaborazione con il CREA, hanno evidenziato come il targeting CRISPR- Cas9 del gene eIF4E-1 estenda lo spettro di resistenza al PVY di Solanum tuberosum


  • In fase preliminare lo sviluppo di linee di pomodoro a ridotto contenuto di allergeni.


    .

programma COST action iPlanta

Si tratta della la più grande rete di scienziati europei attivamente impegnati nella ricerca sui sistemi e le applicazioni di RNAi, tra cui il silenziamento genico indotto dall'ospite (HIGS) e il silenziamento genico indotto dallo spray (SIGS). Tra gli obiettivi di iPlanta vi sono l'identificazione dei requisiti specifici per la valutazione e la gestione del rischio delle piante RNAi e dei loro prodotti (cioè alimenti e mangimi). Tantissimo ci ha lavorato l’ENEA.

In Italia ci sono state due notifiche sulle zanzare geneticamente modificate di uso confinato, con gene drive. In una hanno sviluppato zanzare contro la malaria; nell’altro hanno cercato di ridurre capacità riproduttiva

prodotti commercializzati ma non in italia

SOYBEAN - High Oleic Calyno:
tecnica TALEN; elevato contenuto di acido oleico; sviluppato da Calyxt (US).

TALEN sono strumenti di editing genico estremamente precisi che possono mirare a qualsiasi sequenza e in alcuni casi sono migliori di CRISPR.
Eseguire l'editing senza acido nucleico, discriminare tra le modifiche del DNA come la metilazione che influenzano l'espressione di un gene; modificare il DNA all'interno di organelli come i mitocondri e cloroplasti, che contribuiscono alla funzione cellulare:


riso più aromatico e resistente alla peronospora batterica
patate con un miglior sapore, meno brunenti, e livelli più bassi di acrilammide potenzialmente cancerogena (es. riduzione dei glicoalcaloidi steroidali es. solanina); grano con completa resistenza all'oidio

  • Pomodoro Sicilian Rouge High GABA (Sanatech Seed): contiene alti livelli di acido g-amminobutirrico (GABA), un aminoacido che si ritiene aiuti il rilassamento e la riduzione della pressione sanguigna. Nel dicembre 2020 è stato notificato all’autorità competente giapponese. Ora commercializzato.
  • Banane “non brunenti” di Tropic (aprile 2023): prodotto ottenuto tramite CRISPR. Primo prodotto che ha superato il processo di regolamentazione nelle Filippine. Riducono lo spreco del 25% nel trasporto

(Secondo la normativa si potrebbero fare le prove in campo in Italia, è una decisione di tipo regionale locale, la regione deve trovare lo spazio e il Ministero dell’Agricoltura deve fornire i protocolli. I protocolli nella realtà esistono già, ma regione e Ministero non si parlano, quindi si potrebbe fare ma non lo fanno. Recentissimamente questa cosa sta migliorando e si faranno delle prove in campo per il genome editing. Negli altri paesi si fanno già da diversi anni (es. Belgio, Svezia):

In Belgio: Hanno scoperto che la disattivazione di un componente strutturale che aiuta il ripiegamento del DNA porta a un DNA meno compatto e quindi più attivo.
Quindi le piante di mais dimostrano una crescita migliore in serra quando sono sottoposte a siccità. Ora sono passati alle prove in campo e stanno facendo tre prove in campo differenti, per valutare se questa modifica genetica è vantaggiosa anche in condizioni diverse.

  • Tilapia modificata in Argentina tramite editing: miglioramento del 70% della resa in filetto, del 16% del tasso di crescita e del 14% nel rapporto di conversione in mangimi. Il fatto di essere stato editato con CRISPR e non contiene DNA estraneo ha reso questo prodotto esente dalla normativa sugli OGM argentina.

Mostarda verde:poco pungente (SDN1 - knock out di geni)
Grano con basso contenuto di asparagina e acrilamide
Lattuga non imbrunente
Patata resistente alla Peronospora (tutti questi fatti con SDN1 - knock- out di geni)

livello legislativo

Database che si possono consultare con informazioni sulla salute, il gene drive e l’agricoltura (Global Gene Editing Regulation Tracker), dice la legislazione e cosa hanno prodotto (negli USA non c’è regolamentazione sulla tecnica ma solo sul prodotto).

C’è una differenza su chi basa la regolamentazione sul prodotto (Canada, USA) e chi sulla tecnica ( Europa, Sud Africa), e altri che hanno altre esenzioni come Australia, Argentina e Giappone.
Il Canada invece valuta la qualità del prodotto.
Quindi se lo stesso prodotto è stato ottenuto con tecniche diverse in tempi precedenti non si rivaluta perché non è più novel food.
Il Sud America--> se non è presente DNA esterno basta una semplice notifica e non è necessario fare la valutazione del rischio.
Il Giappone allo stesso modo. (se è SDN1 basta notifica).

Quindi ricapitolando: Giappone e USA considerano le piante SDN1 sicure ed è sufficiente fare notifica dove si dice alle autorità competenti che la pianta è esente da transgeni e quindi non rientra negli OGM.


C’è bisogno di una prova però.
Anche se non c’è una base giuridica che ci permette di discriminare cosa è naturale da cosa è artificiale e questo può spiegare perché chi si basa sul processo non regolamenta la distinzione tra SDN 1, 2 e 3.
Tutti i vari regolamenti differiscono tra loro anche solo per piccoli dettagli, seguono percorsi differenti e quindi è difficile organizzare in modo globale tutti i regolamenti presenti.