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ENZIMI di RESTRIZIONE - Coggle Diagram
ENZIMI di RESTRIZIONE
mezzi
ENZIMI di RESTRIZIONE
sono ENDONUCLEASI =
- effettuano un taglio nel doppio filamento dell'elica di DNA
- scindendo il leg fosfodiesterico
sono dotati di
- specificità
- prendono il nome dal batterio da cui derivano
tagliano in corrispondenza di siti di restrizione = seq palindrome presenti nel DNA (se lette in un verso e nell'altro sono uguali)possono effettuare 2 tipologie di taglio
- taglio netto
l'enzima taglia nello stesso punto entrambi i filamenti
- taglio sfalsato
il punto di taglio NON corrisponde nei due filamenti
→ si creano estremità appiccicose ( = reg di complementarietà )
possono riunirsi fra loro mediante leg H
- questa proprietà può essere sfruttata per unire frammenti di DNA di molecole diverse ma tagliati con lo stesso enzima di restrizione
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-
FUNZIONE
i batteri producono enz di restrizione per proteggersi dagli attacchi di virus
- tagliano il DNA virale che si è stato incorporato a quello batterico
- in questo modo lo frammentano
- annientano il DNA virale
SISTEMA RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE
il DNA batterico possiede mecc di protezione dagli enzimi di restr
- metilazione del DNA
metil-transferasi agg gr metile nei siti di restrizione che NON devono essere tagliati
→ DNA che NON è batterico viene attaccato
ANALISI del GENE
- utilizzo enz di restriizone per isolare frammenti di DNA = seq geniche dai cromosomi
- effettuo elettroforesi per separare i frammenti in base alla carica elettrica e dimensione
- carica elettrica dei geni = è UGUALE per tutti perchè è data dai gr fosfato
- dimensione = è il reale parametro che separa le seq geniche
- formazione di bande, NON visibili ad occhio nudo
- per evidenziarle si usa etidio di bromuro che si intercala fra le basi
- utilizzando un diverso enzima di restrizione si ottengono seq di linghezza diverse
- sapendo incrociare i dati si può risalire alla lunghezza reale della seq di DNA
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- se il DNA è molto lungo
- i siti di restrizione sono molto vicini fra loro
- tra un taglio è l'altro cè una differenza di poche basi
- i frammenti di DNA in lunghezza differiscono di molto poco
- si ottiene una banda continua sfumata
come mettere in evidenza 1 solo gene?
- si saggiano tutti i frammenti presenti con una sonda
- la quale si complementa SOLO alla sua seq complementare = il gene che voglio isolare
- quel gene sarà fluorescente grazie alla fluorescenza conferitagli dalla sonda
è una tecnica che permette di evidenziare una seq di DNA, una seq di RNA o delle proteine
- Southern Blot → DNA
- Northern Blot → RNA
- Western Blot → proteine
- frammenti DNA tagliati con enzimi di restrizione
- frammenti separati mediante elettroforesi
- per evitare che il DNA si disperda nella rete di gel (usata per l'elettroforesi)
- si trasferisce il DNA in un filtro di nitrocellulosa
- la base del foglio di filtro è a contatto con carta assorbente imbevuta di slz salina
- slz fluisce trascinando con sé i frammenti di DNA
- che aderiscono al filtro
- si agg nel filtro una sonda complememntare ( = omologa ) alla seq da evidenziare
- seq da evidenziare ibridizzano con la sonda radioattiva
- la loro localizzazione può essere rivelata dall'autoradiografia
come evidenzio le mutazioni?
nel caso si seq mutate queste potrebbero NON essere riconosciute dalla sonda radioattiva → assenza radioattività = presenza mutazione-
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PCR
- si denatura il campione di DNA stampo aumentando la temperatura
per riprodurre il compito della elicasi
- si appaiano i primer, soltanto dopo che la temperatura si sia abbassata (altrimenti i leg H si romperebbero per il calore)
- i primer utilizzati sono di due tipi diversi perchè variano in base alla direzione del filamento
( 5' → 3' ; 3' → 5' )
- si utilizza la Taq polimerasi per effettuare la duplicazione (dato che NON denatura ad alte temperature)
- la quale utilizza come substrato i dATP ovvero nucleotidi con desossiribosio
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BLOTTING
- Un campione di DNA genomico viene trattato con enzimi di restrizione
- successivamente sottoposto ad elettroforesi (gel d'agarosio o di poliacrilammide)
Nel gel sarà possibile osservare una striscia continua; non si vedranno bande nette perché il DNA genomico digerito con l'enzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso molecolare.
- Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA
- Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa a carica positiva
- e sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti
- Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti.
I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici (dovute alle cariche negative dei gruppi fosfato del DNA che si legano alle positive del filtro).
- Il foglio di nitrocellulosa viene quindi immerso in una soluzione contenente una sonda marcata che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio, identificandole.
- A seguito del lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il DNA genomico.
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DELEZIONI
assenza di fluorescenza in determinate seq indica l'assenza di un certo gene
= mancanza di un prodotto genico
MUTAZIONI
l'assenza o diversa lunghezza delle bande continue, in un quadro elettroforetico evidenzia la presenza di mutazioni
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- utilizzo di DDE1 enzima di restrizione che riconosce un sito sul gene ß su cui avviene la mutazione per l'anemia falciforme
- che taglia il gene in due seq
- formazione 2 bande (6 e 4 Kb)
1 allele mutato
- DDE1 NON riconsce più il sito di restrizione che è appunto mutato
formazione di:
- 1 banda (10kb) → allele mutato
- 1 banda da 6 e 4 Kb → allele sano
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analisi di un paziente eterozigote malattia autosomica dominante
- si estrae e si amplifica il DNA di un paziente
- si formano dunque 2 bande, ognuna per ogni allele, che differiscono
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📍 GRUPPI SANGUIGNI
ANTIGENI
ANTIGENI A,B, 0
gli antigeni sono costituiti da
- sostanza H = una catena in comune formata da 5 zuccheri
la quale si forma in risposta all'azione di
- fucosil-trasferasi → agg il fucosio alla sost H
enzima scodificato dal gene H
- sesto zucchero che specifica l'identità dell'antigene (marker di riconoscimento)
- N-acetil galattosammina → antigene A
- galattosio → antigene B
l'antigene si costruisce grazie a:
- fucosil-trasferasi → agg il fucosio alla sost H
- glicosil-trasferasi → aggiunge il sesto zucchero che determina l'identità
(modifica che avviene nel GOLGI)
enzima codificato da un gene polimorfico che mappa sul chr 9
i geni codificano per questi enzimi
infatti la loro assenza o presenza rrisulta nella determinazione di un gruppo sanguigno
- sul chr 9 si trova un locus detto I e contiene 3 forme alleliche
ALLELIA MULTIPLA:
- I^A → è l'allele che specifica per la presenza della glicosil trasferasi che agg antigene A = gr sanguigno A
- I^B → è l'allele che specifica per la presenza della glicosil trasferasi che agg galattosio = gr sanguigno B
- I^0 / i → è l'allele che NON specifica per alcun enzima = gr sanguigno 0
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INTERAZIONE GENICA
l'attività e l'espressione di un gene dipende dal risultato dell'interazione tra quel gene e gli altri geni e dall'ambiente
le interazioni possono essere tra i vari prodotti genici di ogni allele
se:
- l'allele H è mutato quindi NON funziona →
assenza della sostanza H = gr sanguigno 0
anche se sono presenti gli alleli I^A o/e I^B
quindi si ha gr sanguigno 0 in questi casi:
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AGGLUTINAZIONE
il siero del ricevente agglutina i globuli rossi del donatore
OVVERO gli anticorpi presenti nel siero del ricevente ricoscono e distruggono gli antigeni presenti nei globuli rossi del donatore
causa gravi ostruzioni dei vasi che portano a morte del ricevente
FATTORE Rh
è codificato dall'allele D di due geni localizzati in tandem
- allele D → presenza fattore Rh (Rh+)
dominante
- allele d → assenza fattore Rh (Rh-)
recessivo
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ANTIGENE C
ANTIGENE E
si parla di due diverse isoforme frutto di uno stesso gene
- gene codifica per un unico trascritto maturo
- in base allo splicing che subisce il trascritto, questo può tradurre per 2 diversi antigeni:
- splicing tradizionale → antigene C
- splicing alternativo → antigene E
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