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TRASORMAZIONE IN PIANTA - Coggle Diagram

- - - - per l'inserimento nella cellula vegetale serve una ferita inoltre il batterio copre T-DNA con serie di proteine che lo proteggono e lo veicola dentro la cellula vegetale.
        Questi geni portano la pianta a produrre opine, necessarie al batterio, e ormoni vegetali, che portano alla crescita indifferenziata delle cellule
      - i promotori dei geni nel T-DNA presentano regioni consenso eucariotiche e non procariotiche, inoltre i promotori sono estremamente forti
      - I "right border" (RB) e "left border" (LB) sono due sequenze di DNA che delimitano il TDNA
  - - - Che promotori uso?
        
        35S: promotore del virus del mosaico del cavolfiore.
        ha espressione ad alti livelli quasi dappertutto.
        Si usa comunemente
        
        PEP carboxylase: promotore attivo solo in alcuni tessuti. Ha una maggiore espressione in parte aerea
      - Che gene uso?
        che regione codificante salgo tra quelle di più successo
        
        Gene per tossina Bacillus thuringensis
        
        Gene che media resistenza al Roundup (un erbicida
      - Che terminatore uso?
    - - si parte da pianta in coltura sterile con foglie piccole.
        
        Dalla foglia sterile ricavo dischetti fogliari che incubo con agrobatterio tramite
        
        passati un paio di gironi di incubazione lavoro i dischetti e li metto in terreno con quali livelli di auxina e citochinina = callo
        
        abbasso il livello di auxina rispetto alla citochimica= germoglio
        
        il contrario per il germoglio
        
        in 6mesi ottengo la mia piantina
    - - parto dalle le silique già formate.
        
        Aspettiamo di avere tanti fiori la immergiamo a testa in giù in soluzione di agrobatterio, faccio il vuoto, faccio ritornare in dentro aria questo fa sì che pianta si succhia dentro soluzione con agrobatterio
        posso selezionarmi i semi già trasformati.
  - - - uno contiene l’origine di replicazione, un marcatore di selezione in pianta, un marcatore di selezione in batterio il T-DNA;
      - (plasmide T-Helper) i geni vir
    - - promotore e terminatore da utilizzare
        
        codon usage dell’organismo
        
        regioni trascritte e non tradotte (regioni UTR, almeno il 5’)
        
        cryptic splice sites nel caso di geni batterici (siti non di splicing ma riconosciuti come tali) e introni nel caso di geni eucariotici
        
        uso di enhancer della traduzione e di peptidi segnale
        (un esempio dell’importanza del peptide segnale in pianta è dato dalla biosintesi degli aa aromatici, questa avviene nel cloroplasto è l’assenza di un peptide segnali ne impedisce la produzione).
        
        Bisognerà considerare non solo dove si vuole che il gene venga espresso ma anche dove avvengono le fasi della biosintesi.
- - - - CIRCUITI GENICI
        l’introduzione di diversi geni, in grado di regolarsi l’un l’altro attraverso feedback positivo/negativo
        
        per disegnare un circuito genico bisogna rispondere a diverse domande:
        
        cosa si vuole ottenere?
        Bisognerà quindi identificare i geni di interesse dai quali partire
        
        Cosa bisogna fare per raggiungere un dato obiettivo?
        Bisognerà sottoesprimere o sovraesprimere un gene attraverso diverse tecniche
        
        -OVEREXPRESSION
        → consiste nella sovraespressione di un gene, generalmente è associata alla gain of function, ovvero l’espressione di un gene in un tessuto o in cellule che generalmente non lo esprimono.
        Può essere ottenuta cambiando il promotore di un gene inserendo un promotore forte (es: 35s del CMV) mediante genome editing o sfruttando agrobatterio.
        Si può procedere per espressione costitutiva, portando ad esprimere il gene in tutte le cellule, o inducibile.
        
        KNOCK-DOWN
        → consiste nella riduzione dell’espressione di un gene, si usano i siRNA o Crispr/Cas9;
        in questo caso il gene viene espresso prima che possa essere inattivato, in quanto i sistemi funzionano contro i prodotti del gene.
        Si usa principalmente nel caso di geni essenziali.
        
        KNOCK-OUT
        consiste nell’inattivazione di
        un gene, si può struttare il T-DNA o il sistema Crispr/Cas9
  - - - Il sistema Gateway si basa sull'utilizzo di siti di ricombinazione specifici chiamati attB e attP.
        
        il DNA target da clonare viene inserito nel vettore di ingresso Gateway tramite una reazione di PCR o clonaggio tradizionale. Il vettore di ingresso contiene i siti di ricombinazione attB ai suoi estremi.
        
        il vettore di ingresso con il DNA target viene utilizzato in una reazione di ricombinazione con un vettore di destinazione Gateway desiderato, che contiene i siti di ricombinazione attP. Questa reazione di ricombinazione viene catalizzata da un enzima chiamato integrasi della ricombinasi, che promuove lo scambio dei frammenti di DNA tra i siti attB e attP
      - Il risultato della reazione di ricombinazione è il trasferimento del DNA target dal vettore di ingresso al vettore di destinazione, creando un costrutto genetico completo. Questo costrutto può quindi essere utilizzato per l'espressione genica, la sovraespressione proteica, l'analisi funzionale dei geni e altre applicazioni.
    - - è un metodo di clonaggio in vitro che → il sistema si basa sull’uso dell’esonucleasi T5, con attività 5’-3’, che permette di generare regioni di sovrapposizione tra diversi frammenti di DNA
        Il processo coinvolge l'assemblaggio dei frammenti di DNA e del vettore di clonaggio in presenza di enzimi specifici, seguito da cicli di incubazione termica.
        
        L'enzima polimerasi riempie le lacune tra i frammenti di DNA sovrapposti, e ligasi
        quindi sono in grado di chiudere i gaps che potrebbero formarsi durante la reazione.
        mentre l'esonucleasi elimina le sequenze sovrapposte non appaiate.
        
        Permette di unire anche più di tre componenti con una certa direzionalità,
    - - il sistema si basa su enzimi di restrizione del tipo IIS in grado di tagliare al di fuori della regione di riconoscimento, questo permette di personalizzare le regioni di taglio e di ottenere frammenti che possono essere assemblati con una data direzionalità, si tratta quindi di un’evoluzione del sistema Gibson Assembly
- - - - QUINDI: Cas9 non riconosce i singoli crRNA, ma contiene al suo interno l’RNA che ha una parte complementare alle regioni conservate.
        In particolare, Cas9 ha all’interno una parte di RNA che è identico a uno dei due filamenti di DNA fagico, per cui usando questo come sonda, Cas9 va sul genoma virale corrispondente e lo taglia, aiutando il batterio ad essere resistente.
  - - - geni che codificano per il tracrRNA
      - geni che codificano per il Cas9;
      - ripetizioni CRISPR, che sono fatte da queste parti variabili che corrispondono ai diversi frammenti di DNA patogeno e da altre parti che sono ripetute.
    - - un tracrRNA con un particolare crRNA vicino ( che possiamo già fondere dato che normalmente sarebbero state due cose distinte),
      - un Cas9
      - un sgRNA,ovvero un RNA guida singolo (che corrisponde al tracrRNA).
      - grande contributo di Charpentier e Doudna
        
        nel fatto che si sono resi conto che potevano sintetizzare un piccolo pezzettino di acido nucleico sintetico che legasse queste due molecole tra di loro (crRNA e tracrRNA), e che prende il nome di Linker loop.
        
        se si apre questo costrutto, esso diventa una molecola lineare e quindi, con una sola molecola possiamo dare tutte le istruzioni alla cellula per fare quello che ci serve
        
        Proteina Cas9
        ● **sgRNA
        ● piccoli siti target** che si trovano vicini alla regione d’interesse (siti PAM)
        
        sgRNA o "single guide RNA",è composto:
        una sequenza di RNA guida (guida RNA) e una sequenza di RNA scaffold.
        La sequenza di RNA guida è progettata per essere complementare alla sequenza di DNA bersaglio nel genoma, mentre la sequenza di RNA scaffold fornisce una struttura stabile al sgRNA.
  - - - Ecco perché Cas9 è utile può effettuare un taglio che può essere riparato, quindi grazie ad esso noi mettiamo insieme la capacità della proteina Cas9 di essere guidata sul DNA da un pezzo di RNA (che è responsabile di dove agirà) con il sistema di riparo della cellula che permette al DNA di sopportare il danno subito e tornare ad essere un DNA intero senza interruzioni, e che, di conseguenza,può trasmettere questo difetto alle cellule figlie e, successivamente, alle generazioni successive.
    - - il Non-homologous end joining (NHEJ),
        che riesce a riparare il danno causando però delezioni ed inserzioni, per cui diciamo che non collega le due estremità del DNA, ma lavora lì intorno ricostruendo il pezzo mancante che può essere soggetto a mutazioni
        tra i più usati
        
        DIFFERENZE
        NHEJ causiamo inserzioni e delezioni
        HDR, inserendo il pezzo mancante preso dal DNA complementare, non abbiamo mutazioni di questo tipo, e possiamo scegliere dove precisamente mettere il gene: potremmo decidere di tagliare a monte e a valle di quel gene, eliminarlo e metterne un altro.
      - la riparazione diretta dall’omologia (HDR)
        o riparazione per ricombinazione omologa= Consiste nello scambio di materiale tra due molecole molto simili tra loro.
        
        Un esempio è lo scambio tra due molecole di DNA figlie: appena è avvenuta la duplicazione, se durante questa fase c’è stato un problema che ha portato al taglio, ci si trova nella situazione in cui una delle due molecole figlie è rotta mentre l’altra è buona, per cui si usa quella integra per riparare l’altra prima che il DNA venga separato nelle due cellule figlie.
        Il riparo per omologia presuppone che ci sia un altro DNA identico da cui prendere l’informazione per riparare il DNA danneggiato.
        
        caso mucche
        
        quelle da latte possiedono le corna al contrario di quelle che non producono latte.
        Tutto il corno della mucca inizia a svilupparsi perché viene acceso un fattore di trascrizione ad un certo punto dello sviluppo.
        Esistono delle mucche che non hanno le corna, ed infatti hanno una versione mutata del gene che codifica per quel fattore di trascrizione.
        La cosa migliore è quella di incrociare tra di loro le mucche da latte e quelle che non hanno le corna, e inserire tramite incroci l’allele senza corna.
        Ovviamente, fare incroci è faticoso dato che poi andrebbe pulito anche il genoma, per cui è molto più semplice prendere il gene di una cellula di mucca con le corna, e sostituirlo al gene che non porta alla formazione di corna tramite HDR.
        
        Questo sistema è detto Knock in o replacement,
        prima da una parte fai il knock out togliendo quello che c’era, e poi ci inserisci ciò che vuoi. In questo modo otteniamo un’inserzione precisa che non porta a delezioni.
        
        servono almeno due tagli per inserire il gene d’interesse,
        per cui conviene disegnare 2 sgRNA per tagliare due estremità del DNA, eliminare tutto ciò che c’è nel mezzo di queste estremità e inserire un gene nuovo intero.
        
        esempio di cassetta:
        1- promotore classico e Cas9: Il promotore classico è una regione del DNA che attiva la trascrizione dell'RNA messaggero (mRNA) a partire dalla molecola di DNA corrispondente. In questo caso, il promotore classico è responsabile dell'espressione del gene Cas9. La proteina Cas9 è l'endonucleasi utilizzata nel sistema CRISPR-Cas9 per tagliare il DNA in posizioni specifiche.
        2- Promotore Pol III e sgRNA: Il promotore Pol III è una regione del DNA che guida la trascrizione dell'RNA tramite l'enzima RNA polimerasi III (Pol III). In questo caso, il promotore Pol III viene utilizzato per guidare la trascrizione dell'RNA che costituisce l'sgRNA (single guide RNA).
        3- elemento da selezionare: Questo elemento può essere un gene o una sequenza specifica nel DNA che desideri modificare. Può essere un gene bersaglio che vuoi eliminare (delezione) o un'inserto che desideri introdurre (inserzione).
        Il sistema CRISPR-Cas9 utilizza l'NHEJ (Non-Homologous End Joining), un meccanismo di riparazione del DNA, per introdurre modifiche come delezioni o inserzioni.
        L'orientamento dei componenti (promotori e Cas9) può variare, ma è importante garantire che il promotore Pol III sia in grado di trascrivere l'sgRNA in modo corretto per guidare Cas9 al bersaglio desiderato.
        
        caso esempio
        
        abbiamo il nostro vettore (il plasmide di Agrobacterium) con dentro il T-DNA. A questo punto trasformiamo la pianta
        
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  - - - Questo articolo parla di gene targeting mediato da CRISPR\Cas9 in Arabidopsis usando trasformazioni sequenziali, quindi non trasformando una volta sola ma più volte con diversi elementi in sequenza.
      - È stato trovato che la linea parentale, che esprime l’endonucleasi Cas9 batterica dalla cellula uovo e dall’embrione precoce con uno specifico promotore, può migliorare la frequenza del Knock in da parte di sgRNA, e le sostituzioni di sequenza utilizzando la ricombinazione omologa su diversi siti endogeni di Arabidopsis.
        
        Questo gene targeting ereditabile può essere identificato usando la PCR e questo approccio rende possibile la manipolazione di routine e di precisione del genoma di Arabidopsis
      - STRATEGIA:
        
        Prendiamo il primo costrutto che parte da RB (right border), poi troviamo Cas9, l’sgRNA+ il promotore da Pol III (ovvero AtU6), un'altra Cas9 con il suo promotore, un marcatore di selezione HPT, e poi il LB (left border)
        Loro trasformano Arabidopsis (che già contiene Cas9) con un altro costrutto RB-LB dove dentro troviamo il donatore e il 35S bar, dove bar è il gene che permette alle piante di resistere al glifosato e che viene chiamato anche Basta selection.
        la linea parentale (T0) che già contiene Cas9 viene ritrasformata con un costrutto che contiene un sgRNA e un donatore.
        
        dalla T0 si ottiene la T1,
        va ricordato che in Arabidopsis si vanno a trasformare direttamente solo i semi.
        Ecco perchè avere un promotore che è attivo nella cellula uovo dell’embrione è perfetto perchè si va a guardare solo la linea germinale, quindi non serve che il resto della pianta sia trasformata con Cas9.
        Le T1 vengono selezionate con il Basta selection e portano ad una serie di linee indipendenti trasformate.
        
        Cosa fare con i semi raccolti da queste piante?
        Abbiamo un tipo di strategia a nostra disposizione, che si è usata anche all’inizio quando si sono fatti gli screening in banca dei mutanti di DNA e consiste nella PCR a gruppi:
        -ho molti semi, questi vengono divisi in gruppi,
        
        le piante vengono crescere,
        
        poi viene fatta un’estrazione di DNA in ogni gruppo con la quale fare una PCR e confrontarla con quella di altri gruppi.
        
        Il gruppo che poi dà un segnale positivo viene analizzato internamente con misure singole.
        
        Questo è il sistema accelerato per ovviare al fatto che la ricombinazione omologa nelle piante è molto improbabile, e funziona solo se si hanno a disposizione molte cellule e manodopera, ma sicuramente contribuisce a ridurre la complessità del processo
        
        in questo caso quando sequenziamo dobbiamo fare attenzione in quanto abbiamo delle linee dove solo una N del genoma è trasformata mentre l’altra no, per cui dobbiamo capire bene dove usare i primer in modo da evitare di avere il segnale distorto.
        Infatti, può capitare che il primer durante il sequenziamento si leghi sia al gene wild type che a quello mutato, e di conseguenza otteniamo due amplificati che vanno separati e sequenziati uno alla volta
        
        . Un altro problema è quello degli Off-Target Effects (abbastanza raro), che riguarda la possibilità che siano avvenute altre inserzioni/delezioni nei geni vicini a causa di tagli impropri di Cas9.
        Il rischio di off-targeting può essere minimizzato o evitato selezionando sequenze target altamente specifiche, ottimizzando la specificità di targeting del sistema CRISPR/Cas9 oppure prestando molta attenzione durante la fase di progettazione degli sgRNA.
        Tutto questo funziona proprio perché la maggior parte dei genomi utilizzati sono già stati sequenziati.
        
        Cas9 è un gene batterico, quindi è ovvio che ci vuole il sito di localizzazione nucleare se lo vogliamo mettere in una cellula eucariotica.
        Inoltre, vanno sempre utilizzati dei codoni che siano quelli che si usano per le piante per migliorare l’espressione, e poi dei promotori specifici che possono essere sia costitutivi che quelli con un’alta attività nelle cellule germinali o nei tessuti in divisione in modo da migliorare l’efficienza di editing.
      - Cosa inventano questi studiosi per cercare di migliorare l’efficienza?
        Cas9 prima veniva messa semplicemente sotto al promotore 35S, mentre loro hanno messo questa endonucleasi sotto un altro tipo di promotore nell’embrione e nella cellula uovo, in quanto in quel momento il genoma di Arabidopsis è più plastico.