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QUALIDADE DE SEQUENCIAMENTO MURILO CERVATO, FAZER EXERCÍCIO NO BASESPACE …
QUALIDADE DE SEQUENCIAMENTO
MURILO CERVATO
QUALIDADE DE NGS
Avaliação da qualidade (SAV - sequence analisys view)
Software para avaliar métricas de sequenciamento
Há programas locais (ex Local Run Manager) ou remoto (SAV)
SAV
Necessário arquivos da corridas
Pasta InterOp; RunInfo.xml; RunParameters.xml
(Tumbnail_Images contém imagens da corrida)
Importante acompanhar:
Qualidade de incorporação de bases - Q30
%PF
Densidade de cluster ou % de ocupação
TELA 1 SAV:
TELA 2: IMAGENS
TELA 3: RESUMO
TELA 5: Resumo das médias dos pares de bases
TELA 6:
Densidade de cluster
CLUSTER
È necessário que o oligonucleotídeo (adaptador) da flowcell seja compatível (complementar) ao adaptador da biblioteca.
Flowcells non-patterned:
Nos primeiros ciclos, a flowcell é mapeada para avaliar se há cluster e em que posição está.
(se lê sequências consenso do adaptador). É chamado
template generation
Flowcell patterned
: Já tem os nanopoços mapeados (não possui template generation). - densidade é 1 cluster por poço e é fixo
Termo correto para carregamento
(sintomas não ótímo)
underloaded
ocupação baixa
PF baixo
overloaded
ocupação alta
PF baixo
Há sequenciadores com até 4 leituras de cores
Há sequenciadores com até 2 leituras: intermediário verde-vermelho A, nada G, Verde T, Vermelho C. - tira só duas fotos, sendo mais rápido (A e T é jogado junto), (G e C são jogados juntos)
Há sequenciadores com 1 leitura: usa só a cor verde com tempos de emissão diferentes, permite identificar todas as bases.
densidade de cluster
- quantos cluster tem por área (medido em cluster por mm². É avaliado em non-patterned flowcell.
Under e overcluster
é uma métrica de densidade de cluster, apenas para as
non-patterned flowcell.
É avaliado entre os ciclos 1-25 do R1. Se o cluster é distinguível é integrado ao passing filter.
taxa de ocupação
de todos os poços disponíveis, quantos clusters estão ocupados. (relevante para a patterned flowcell
passing filter
de todos os clusters, quantos são viáveis para gerar dados.
FAZER EXERCÍCIO NO BASESPACE