REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI
- CONTROLLO TRASCRIZIONALE:
Il fattore trascrizionale deve poter raggiungere la propria sequenza consensus, farsi largo attraverso la cromatina. Esiste un controllo che si impone sul fattore trascrizionale, e tramite un meccanismo di apertura/chiusura rende accessibile o inaccessibile il Dna trascrizionalmente: il controllo epigenetico.
Questo fa sì che tutte le cellule di un organismo abbiano uno stesso genoma ma epigenomi diversi. decompattare il Dna.
Ogni coda istonica ha dei determinati amminoacidi modificabili post- traduzionalmente per opera di enzimi.
Le modifiche sono alla base dell’espressione genica tessuto-specifica ma anche di fenomeni che abbiamo già visto come l’inattivazione del cromosoma x e l’imprinting genetico.
MODIFICAZIONI EPIGENETICHE:
I vari meccanismi si rinforzano tra loro, infatti un gene completamente represso è metilato e iperacetilato. Meccanismi multipli che rendono il gene: chiuso, leggermente aperto, totalmente aperto.
C’è coerenza finale funzionale, perché un substrato di DNA metilato richiama anche la deacetilazione degli istoni.
Le modifiche sono:
Locali;
Ereditabili, ma modificabili: questo è possibile per la presenza di proteine in grado di interagire con il DNA anche se compatto. Sono dette pionieri, riconoscono una sequenza, e richiamano meccanismi di attivazione (epigenetici).
Gli istoni oltre ad aprire e chiudere si possono anche spostare fisicamente in determinate regioni.
- Per avere un gene attivo: devo avere la cromatina iper-acetilata e DNA demetilato;
- Per avere un gene silenziato: devo avere deacetilazione e metilazione nelle isole CpG.
Non tutto ciò che è modificato geneticamente in una determinata maniera viene azzerato durante la gametogenesi, esistono regioni che sono mantenute.
MODIFICAZIONI EPIGENETICHE DEL DNA:
Il DNA può essere metilato in particolari citosine, che diventano metil-citosine, situate
in specifiche regioni del DNA dette "isole CPG", collocate nei promotori e negli enhancer,
Circa l’1% delle citosine è metilato e il 60%
dei geni umani presenta le isole CPG al 5’.
Se il promotore è metilato non abbiamo interazione con il fattore trascrizionale della RNA polimerasi, quindi la metilazione delle isole CpG ha un effetto repressorio.
La metilazione del DNA avviene grazie a due enzimi:
DNMT1 —> E' in grado di rimettere i metili
sull’elica di neostampo quando questi sono
presenti nell’elica parentale: è in grado di perpetuare
DNMT3 —> DNA metilasi de novo, ovvero sa metilare entrambe le eliche che non sono
metilate.
EPITRASCRITTOMICA:
Da qualche anno si stanno scoprendo altre modifiche, sotto il nome di epitrascrittomica, modifiche dei trascritti tramite metilazioni, che hanno un impatto sullo splicing, biogenesi, funzionamento dei messaggeri e delle altri classi di RNA. Il DNA può essere modificato, ma anche gli elementi a valle, come i trascritti, possono essere modificati e queste modifiche hanno un effetto funzionale.
TANTI EPIGENOMI:
Ciò che dobbiamo ricordare è che per ogni individuo abbiamo un genoma specifico ma tanti epigenomi, tanti quanti tipi cellulari differenziati esistono; questo differenziamento è anche modulabile. L’epigenoma specifico è tessuto-specifico, cellula-specifico (perché anche in un tessuto possiamo trovare cellule differenti) e momento-specifico perché modificabile da ripensamenti locali, dovuti dalla comunicazione del nucleo con l’ambiente esterno.
FATTORI TRASCRIZIONALI: UN GENE È REGOLATO DA MOLTI FATTORI TRASCRIZIONALI, OGNI FATTORE TRASCRIZIONALE REGOLA MOLTI GENI.
FATTORI MASTER:
Sono definiti fattori "master’’ quelle molecole la cui presenza è necessaria ma è soprattutto
sufficiente ad iniziare una serie di eventi. E' sufficiente perché lavora su molti geni e nei geni da esso regolati, ci sono altri fattori trascrizionali che implementano la sua funzione. Un master è in grado di iniziare la serie di eventi che risultano in un controllo della regolazione genica.
L’attività di un gene è condizionata da più fattori e lo stesso fattore è ritrovato in contesti
diversi. Tutto ciò permette un controllo combinatorio dell’espressione genica e a partire dalla
presenza o assenza di pochi fattori si vanno a creare differenziamenti diversi.
I due livelli epigenetica e fattori trascrizionali sono in comunicazione tra loro: l’epigenetica è
propedeutica alla possibilità del fattore trascrizionale di legare, però i fattori trascrizionali
sono modificatori di epigenetica, quindi si parlano tra loro.
Ci sono quindi proteine attivatrici propedeutiche a fattori generali di trascrizione, i quali a loro volta sono propedeutici all’arrivo dell’RNA polimerasi con cui avremo la trascrizione. I due livelli
(epigenetico e fattori trascrizionali) condizionano l’inizio della trascrizione ed il suo
svolgimento.
2.PROCESSAMENTO:
Il passaggio di processamento è fonte di vari livelli regolativi.
Lo splicing alternativo è importante perché il 90% dei geni umani codifica per pre-mRNA che verranno processati diversamente attraverso lo splicing alternativo, facendo sì che non tutti gli esoni rimangano nel messaggero maturo. La conseguenza di ciò è che, se da un solo trascritto primario puoi ottenere messaggeri diversi, vuol dire che da un gene puoi ottenere più proteine, perciò il proteoma è più complesso del genoma.
I 22.000 geni codificano infatti per circa 72.000 proteine perché il prodotto medio di splicing
alternativo è 4, quindi ogni gene fa circa 4 proteine diverse (anche se non completamente diverse perché sono costituite dagli stessi esoni ma non li comprendono tutti). Un singolo
gene può codificare per 2 o più proteine simili grazie a particolari sequenze che vengono riconosciute da proteine regolatrici che determinano quali esoni verranno eliminati; si tratta quindi di un fenomeno regolato.
Si può avere anche il fenomeno dell’exon skipping, in cui un esone viene saltato e si ha la giustapposizione di altri due esoni con la formazione di un messaggero a cui manca una porzione informativa; questo è il principale metodo di splicing regolato.
Ci sono anche fenomeni di intron retention, che di solito sono mutazioni geniche (non è un fenomeno regolato) che toccano il sito di splicing e quindi il macchinario dello spliceosoma non è più capace di riconoscere il sito. Il concetto principale è l’eliminazione di esoni dal trascritto maturo che può essere exon skipping ma anche mutually exclusive exons.
Inoltre si possono avere siti alternativi di splicing sia al 3’ sia al 5’ perché sono presenti sequenze dentro agli esoni che vengono riconosciute come sito di splicing facendo quindi perdere un tratto di esone.
Si avranno proteine diverse che prendono il nome di isoforme, perché sono riconducibili ad una struttura comune per la presenza di esoni comuni ma che nel loro complesso sono diverse tra di loro.
Gli mRNA nel citoplasma possono essere tradotti immediatamente o venire immagazzinati per essere poi tradotti successivamente. Tipicamente, gli mRNA immagazzinati sono associati a proteine che ne inibiscono la traduzione e possiedono code di poliA brevi al confronto con i medesimi mRNA attivi. Segnali presenti nella regione 3'UTR controllano l'accorciamento e l'allungamento delle code di poliA a opera di specifici enzimi.
3.TRADUZIONE E DEGRADAZIONE DELL'MRNA:
NON CODING-RNA:
I non-coding RNA sono classificati per le loro dimensioni, in particolare ci concentreremo su due
estremi:
● microRNA, molto piccoli, costituiti da 23-25 nucleotidi;
● Long non-coding RNA, superiori ai 200 nucleotidi, di cui una delle sue funzioni è già stata svelata quando si è parlato dell'inattivazione del cromosoma X.
I MICRORNA
I microRNA sono stati scoperti nel 1993 negli animali e nelle piante. Il ruolo principale è l'inibizione della traduzione di molti messaggeri che hanno ai loro 3' UTR sequenze complementari a questi microRNA. Tale regione di mRNA ha un potente valore regolativo, che, se complementare al microRNA presente nella cellula, causa un'interazione complessa, mediata da legami a H, che inibisce la traduzione del messaggero.
FUNZIONAMENTO:
Il destino finale del microRNA a singolo filamento sarà di trovare sequenze parzialmente complementari collocate sul 3' UTR di mRNA, considerando che un microRNA rivolge più messaggeri e il 3' UTR del messaggero può essere riconosciuto contemporaneamente da più microRNA.
Quindi è non specifico per un messaggero: il motivo di ciò è che i microRNA hanno una porzione chiamata seed di pochi nucleotidi (7 o 9), che è quella complementare al 3' UTR; pochi nucleotidi che si trovano frequentemente, non hanno specificità rigida per un messaggero ma sono presenti in tanti 3' UTR.
Si ha una ridondanza di funzioni: più microRNA che fanno
lo stesso lavoro, più messaggeri che sono contemporaneamente riconosciuti e più microRNA che riconoscono più messaggeri.
L'appaiamento del microRNA al 3' UTR sarà mediato dal complesso proteico finale e sarà parziale nelle sequenza seed. Dunque non si ha un appaiamento completo perché non tutte le regioni sono complementari (ciò vale negli eucarioti superiori animali).
Una volta che l’interazione tra microRNA e mRNA è avvenuta, si attiva un meccanismo chiamato feedback regolativo, che presuppone un enorme spreco di energie.
Se non si vuole più quel messaggero, perché non si smette semplicemente di produrlo? Perché le cellule comunicano tra loro: una cellula può spegnere il messaggero di un'altra cellula o inibirne la traduzione.
Negli animali abbiamo un’inibizione della traduzione e della stabilità messaggera, nelle piante abbiamo una diretta degradazione del messaggero, in quest'ultimo caso l'appaiamento descritto come parziale è invece totale e può essere in regione 3'UTR, ma può essere anche in qualsiasi regione del messaggero, cosa che
genera una distruzione del messaggero target da parte delle endonucleasi.
In entrambi casi, animali e piante, si hanno meccanismi evolutivi che utilizzano una complicata biogenesi per microRNA finalizzata alla regolazione della quantità di messaggeri, ma che agiscono in maniera diversa: nel caso
degli animali inibendone la produzione e nel caso dei vegetali distruggendo gli mRNa prodotti.
I MicroRNA degli animali si chiamano miRNA, i microRNA vegetali si possono invece chiamare siRNA, perché sono dei silenziatori di messaggeri.
Dalle piante abbiamo imparato questo secondo meccanismo e abbiamo scoperto che anche nelle cellule animali può funzionare: se noi disegniamo nel laboratorio degli oggetti completamente complementari a messaggeri , siamo in grado di abolire quel messaggero, di silenziarlo, perché la complementarietà cambia funzione al complesso che li trasporta.
Quindi parzialmente complementari e in regioni chiamate seed causano una lenta e non totale degradazione, e questo è il motivo per il quale il messaggio è ridondato, ovvero nel 3' dello stesso messaggero ci possono essere più
miRNA che legano contemporaneamente.
I microRNA negli animali hanno, come già detto, un’interazione di tipo parziale; solo il microRNA 196 è noto essere, in alcuni casi con alcuni messaggeri, completamente complementari e causa di taglio.
Da questo è venuta l'ispirazione di disegnare in laboratorio dei piccoli RNA veicolati per raggiungere l'obiettivo di distruggere completamente tramite tagli, in maniera selettiva, dei messaggeri.
LONG NON CODING RNA:
I LncRNA (long non coding RNA), sono uno scenario modernissimo. Definiti come trascritti di polimerasi II più grandi di 200 nucleotidi che non contengono ORF (open reading frame) e che non sono mai tradotti.
Il 43% del genoma umano codifica per LncRNA e solo il 2% codifica per geni tradotti in proteine. Il dogma centrale che dice DNA, RNA, proteine, riguarda il 2% del nostro genoma, tutto il resto è altro, porzioni non trascritte e porzioni trascritte, ma non tradotte.
I geni che codificano per questa famiglia di RNA, possono essere:
unità trascrizionali indipendenti;
antisense naturali, trascritti dallo stend opposto di regioni che contengono geni che codificano per proteine;
introni di geni che codificano per proteine.
La reale struttura finale del non long coding è di difficile previsione e impattata da interazioni multiple, dinamiche, magari condizionate da proteine.
Il punto essenziale è capire con chi interagiscono: interagiscono con DNA, proteine ed altri RNA; quindi, hanno funzioni di creazione di piattaforme, dove l’intervento è mettere l’interazione proteine, proteine-RNA, proteine-RNA-DNA, ecc.
Molti lncRNA possono appaiarsi con miRNA funzionando da esche e interferendo con il riconoscimento dei corrispondenti mRNA bersaglio.
MODIFICAZIONI EPIGENETICHE DEGLI ISTONI
ACETILAZIONE:
Le principali modifiche che possono avvenire sugli istoni sono due: acetilazione e metilazione delle code istoniche.
Le acetilazioni hanno due classi di enzimi: le acetilasi e le deacetilasi, che vanno a modificare determinati siti delle code istoniche.
Acetiliando stiamo “aprendo” la cromatina, cioè la stiamo attivando, quando deacetiliamo la stiamo invece “chiudendo”.
Ciò accade perché stiamo aggiungendo una carica negativa alla coda istonica il cui effetto è la
decompattazione del Dna dagli istoni per un effetto di repulsione tra cariche negative. Questo lavoro è permesso dalle HAT (isto acetil-trasferasi),
addizionando un gruppo acetilico.
Il lavoro opposto viene invece svolto dalle HDAC, che levano il gruppo acetilico, permettendo la
ricompattazione della cromatina.
METILAZIONE:
La metilazione è un meccanismo più complesso, in quanto dipende da cosa e dove stiamo metilando.
Esistono infatti dei residui che se metilati attivano, mentre altri provocano lo "spegnimento" del gene. Vi sono tre lisine, chiamate k4, k9 e k27, su cui lavorano due grosse piattaforme enzimatiche: trithorax (attivatore), e polycomb (repressore).
In senso attivatorio trithorax trimetila il k4, in senso repressorio polycomb trimetila la k27.
MICRORNA NEL GENOMA
Nel genoma, i microRNA sono presenti in varie forme. È possibile trovarli come singola unità trascrizionale o come multipli oggetti da maturare, quasi paragonabili al DNA policistronico (se non fosse che sono frammenti non codificanti), ovvero una serie di microRNA nello stesso trascritto, che possono essere presenti in esoni non-coding, quindi all'interno di altri oggetti a RNA, oppure in introni di messaggeri (questo sottolinea il concetto che gli introni, che si è a lungo pensato fossero inutili, hanno invece anch’essi un potenziale informativo).
BIOGENESI MICRORNA:
I microRNA sono tutti trascritti da polimerasi Il e possiedono un 5' cappato, introni ed un 3'
poliadenilato e nell’uomo sono circa 2000, con precisione 2656 trascritti ma è un numero che
aumenta di anno in anno, e sono tessuto-specifici.
La biogenesi inizia con il trascritto sintetizzato dalla pol II che viene chiamato pri-microRNA, è
caratterizzato da una peculiare conformazione, caratterizzata dalla presenza di parziali regioni di
non complementarietà (ovvero ci sono sia regioni con basi complementari che non).
Tale trascritto primario è poi convertito in pre-microRNA tramite endonucleasi (chiamate Drosha e proteina dgCr8, che formano insieme un complesso chiamato microprocessore che riconosce il substrato
su cui lavorare per la sua struttura e le zone di non complementarietà che lo caratterizzano) che
attuano tagli su siti specifici di questo trascritto e lo liberano dall’estremità 3’, 5’ e da alcune zone
non complementari.
Da tali tagli si genera una struttura a forcina. Il pre-microRNA una volta pronto fuoriesce dal nucleo tramite l’esportina 5. Nel citoplasma si ha poi la conversione del pre-microRNA a microRNA a doppio filamento, passaggio che avviene ad opera dell’enzima Dicer, che attua ulteriori tagli, eliminando la struttura a forcina precedentemente formata. Anche Dicer riconosce il pre-microRNA su cui lavora per la sua struttura, non per la sua sequenza. Questo microRNA a doppio filamento presenta ancora parziale complementarietà e ha raggiunto una lunghezza di 23 nucleotidi.
A questo punto, un apparato finale converte nuovamente il microRNA da doppio a singolo filamento, così da poter essere usato per il controllo traduzionale degli mRNA.
La selezione del singolo filamento da adoperare viene fatta in base alla loro stabilità; possono anche essere usati entrambi i filamenti, ma sempre in maniera separata.
Si ha poi l’intervento di un complesso, chiamato RISC (il cui nome suggerisce funzione inibitoria), costituito da diverse proteine tra cui AGO2, che cattura il singolo filamento ed è guidato sui vari mRNA dal microRNA che esso ha legato, in base alla sequenza nucleotidica che lo caratterizza, e andrà a favorire la complementarietà con alcuni mRNA.
Quindi lo stesso macchinario carica specifici microRNA e ha bersagli diversi.
LIVELLI DI CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI:
Negli eucarioti il controllo dell'espressione genica è più complicato che nei procarioti. La ragione deriva, in parte, dalla compartimentalizzazione delle cellule eucariote e dalle esigenze determinate dalla necessità degli eucarioti multicellulari di generare numeri elevati e tipi diversi di cellule. In particolare, l'assenza nei procarioti di un nucleo circondato da una membrana consente alla traduzione di procedere un un mRNA durante la sua sintesi. in una cellula eucariote la presenza di un nucleo separa i due processi e di conseguenza l'espressione dei geni codificanti per proteine può essere regolata a più livelli:
- Trascrizione;
- Processamento;
- Trasporto;
- Traduzione e degradazione dell'mRNA;
- Processamento e degradazione delle proteine.
IMPRINTING GENOMICO:
Il silenziamento genico mediante mediazione del DNA è alla base dell'imprinting genomico, un importante fenomeno epiqgenetico per cui l'espressione di specifici geni dipende dalla loro trasmissione ereditaria, cioè dalla provenienza dal genitore femminile o dal genitore maschile. Per circa 80 geni dei mammiferi il contributo materno o paterno non è equivalente.
INATTIVAZIONE DELL'X:
Un esempio di lncRNA che agisce in ciò è Xist, fondamentale per la lyonizzazione del cromosoma X nei mammiferi di sesso femminile.