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LA GENETICA DEI BATTERI E DEI BATTERIOFAGI , IL SISTEMA DI ATTIVAZIONE:…

- - - - TRANSCONIUGANTI:
        I riceventi che hanno incorporato un pezzo del DNA del donatore nel loro cromosoma sono chiamati transconiuganti.
      - FATTORE F:
        Il fattore F è ciò che permise ad Hayes nel 1953 di dimostrare che la coniugazione fosse un processo unidirezionale e che quindi ci fossero una cellula donatrice e una cellula ricevente.
        Hayes propose che il trasferimento del materiale genetico tra i ceppi fosse mediato da un fattore sessuale, chiamato fattore F, che dà il senso di "fertilità", posseduto solo dalla cellula donatrice, denominata quindi F+, mentre la ricevente che ne è priva è denominata F-. Il trasferimento quindi avverrebbe solo tra cellule di sesso diverso, tramite un processo che vede la creazione di un pilo, che funziona quasi da gancio che trascina a sé la cellula ricevente accorciandosi, e di un ponte citoplasmatico tra le due cellule.
        Il fattore F non è altro che un episoma, tagliato al momento della coniugazione nel sito di origine in modo da originare due estremità, che serviranno a far iniziare la replicazione, in modo che ciascuna cellula abbia alla fine del processo una copia a doppio filamento.
        Quando tutto il fattore F è trasferito e circolarizzato, la cellula F- si trasformerà in una cellula F+.
        
        EPISOMA:
        L'episoma è un tratto di DNA circolare batterico capace di replicazione autonoma, indipendente dal cromosoma batterico ma in grado di integrarsi in esso. E' lungo circa 10^5 coppie di basi e contiene una regione di DNA, chiamata origine di trasferimento (OriT), che è il punto nel qual l'episoma si apre e dal quale ha inizio il trasferimento del DNA al ricevente. Contiene inoltre alcuni altri geni che determinano la formazione sulla superficie cellulare di specifiche strutture filiformi, chiamate pili F o pili sessuali che permettono l'unione fisica fra le due cellule F+ ed F-.
        Non sono indispensabili, ma come i plasmidi, anch'essi elementi aggiuntivi del patrimonio genetico di una cellula aploide, possono conferire importanti vantaggi selettivi.
        
        CEPPI HFR:
        I ceppi HFR, devono il loro nome alla loro alta capacità di ricombinazione, non omologa, tra il fattore F e il cromosoma batterico. Derivano dai ceppi F+, ma la particolarità sta nel fatto che una volta che il fattore F è stato integrato nel genoma batterico, questo non replicherà più in modo indipendente, ma come parte del cromosoma ospite.
        La situazione che ci dobbiamo aspettare è quindi quella in cui oltre al fattore F venga trasferito anche una parte del genoma batterico del donatore, che una volta all'interno della cellula ricevente inizia processi di doppia ricombinazione con le stesse porzioni del DNA del ricevente. Si tratta di una situazione di merozigosi parziale, che riguarda il tratto che è riuscito ad entrare insieme a parte del fattore F, la zona limitrofa a questo.
        Negli incroci Hfr e F-, la ricevente non riceve mai il fenotipo Hfr in quanto è difficile che l'interazione tra le due cellule, donatrice e ricevente, tramite il ponte citoplasmatico, duri abbastanza da permette il passaggio completo di tutto il pacchetto compreso di fattore F e di cromosoma batterico, dato che l'origine da cui il fattore F inizia ad essere trasferito si trova all'interno dello stesso fattore F: ciò che ci possiamo aspettare è una situazione simile a quella iniziale, il risultato sarà avere comunque una cellula F-, dato che il passaggio dell'episoma non è completo (riuscire a mantenere due cellule di Eschericia Coli in contatto per 100 min a 37° è difficile, ma comunque non impossibile, quindi le eccezioni a questo caso possono esserci) e una cellula Hfr.
        
        FATTORE F':
        Il processo inverso di escissione del fattore F dal cromosoma batterico è possibile, avviene anch'esso spontaneamente ma raramente, ma soprattutto è impreciso. Ciò implica che il fattore F escisso dalla cellula Hfr possa contenere anche una piccola porzione del cromosoma dell'ospite adiacente al fattore F nel momento in cui era ancora integrato.
        I fattori F che nel processo di escissione dal cromosoma batterico si portano accanto una parte di questo e ne risultano quindi arricchiti vengono rinominati F'. I fattori F' prendono il nome dai geni che hanno prelevato.
        Come nell'incrocio tra batteri F+ ed F-, anche in questo caso il trasferimento dell'epigona arricchito può avvenire in modo completo (il tratto di DNA lineare da passare da una cellula all'altra è più corto di quanto lo sarebbe quello di un ceppo Hfr) e dall'incrocio F'xF- si ottengono due cellule F'.
        La cellula ricevente, tramite eventi di ricombinazione omologa, può integrare in essa i pochi geni trasportati dall'F' e tramite questo tipo particolare di coniugazione, definito sexduzione o F-duzione, si possono organizzare esperimenti in cui studiare la dominanza o la recessività di particolari geni analizzandone il fenotipo in eterozigoti, cosa tranquillamente fattibile in una cellula diploide ma non in una aploide come quella del batterio.
      - MEROZIGOSI:
        La merozigosi è una diplopia parziale e temporanea in organismi apolidi come quelli batterici.
      - RISULTATI DELLA CONIUGAZIONE:
        F+ x F- = Due cellule F+
        
        F- x Hfr = Una cellula Hfr ed una F-
        
        F' x F- = Due cellule F'
    - - TRASFORMANTI:
        Se avviene ricombinazione tra il DNA esogeno e quello endogeno è possibile l'acquisizione di nuova informazione da parte della cellula trasformata e i riceventi che in seguito alla trasformazione presentano un nuovo fenotipo vengono detti trasformanti.
      - ETERODUPLEX:
        Durante l'assunzione del DNA, uno dei due filamenti viene degradato cosicché nelle cellula se ne ritrova solo uno intatto.
        La ricombinazione che avviene in batteri che subiscono la trasformazione è promossa dalla proteina RecA, ed è particolare, in quanto il singolo filamento lineare si appaia con la regione omologa del cromosoma del ricevente, formando una struttura a tre filamenti, e un doppio crossing over porta alla formazione di un cromosoma ricevente ricombinante, per cui le due eliche del DNA portano l'una l'informazione genetica del donatore, l'altra quella del ricevente.
        Ciò che succede è che abbiamo modificato il destino di una delle due cellule figlie che genereranno dalla cellula madre con un genoma così particolare: un cromosoma della progenie porterà l'informazione genica del donatore su entrambi i filamenti e sarà un trasformante, mentre l'altra cellula sarà semplicemente non trasformante.
      - COMPETENZA:
        Una cellula competente è quella che può attuare una trasformazione naturale perché ha costruito evolutivamente strutture precise, quali pori della parete e nella membrana cellulare che consentono al DNA di entrare nella cellula per poi essere modificato.
        (Solitamente posseduto dai batteri Gram+)
    - - TRASDUTTANTI:
        Una volta introdotto nella cellula ricevente, il nuovo DNA può andare incontro a ricombinazione con la regione omologa del cromosoma del ricevente: questi riceventi prendono il nome di trasduttanti.
      - TRASDUZIONE GENERALIZZATA:
        La traduzione generalizzata è associata a betteriofagi litici. Durante il ciclo litico infatti il DNA viene degradato e in rare occasioni frammenti di DNA batterico possono essere impacchettati nella testa del Fago al posto del DNA proprio del virus, ma si tratta di appunto una trasduzione generalizzata in quanto il pezzo di DNA batterico assunto è un pezzo casuale e non vi è selettività.
        
        CICLO LITICO:
        Nel ciclo litico il fago si lega alla parete batterica, introduce il suo cromosoma circolare nel citoplasma lasciando fuori la porzione proteica, costringe ai propri voleri l'apparato traduzionale della cellula e una volta replicato il proprio DNA e ricostruito tante unità fagiche comprese di capside, provoca la lisi della cellula e la demolizione del materiale genetico batterico.
      - TRASDUZIONE SPECIALIZZATA O RISTRETTA:
        Alcuni batteriofagi temperati possono trasdurre solo determinate parti del cromosoma batterico: in questo caso si parla di trasduzione specializzata, associata al ciclo lisogeno.
        Al momento dell'escissione del cromosoma virale da quello batterico potrebbero essere reclutati anche i geni batterici limitrofi a quello virale, per questo si parla di trasduzione ristretta.
        Se il virus ha un sito di integrazione specifico e l'escissione non avviene correttamente, questo potrebbe assumere i geni che decidiamo noi. Potremmo quindi spostare geni specifici da un batterio all'altro per esempio per costruire ceppi con particolari genotipi.
        
        CICLO LISOGENO:
        Per iniziare il ciclo lisogeno, il DNA del fago si integra nel cromosoma batterico, in questo stadio il cromosoma fatico si chiama profago, e quando il batterio cresce e si divide, la replicazione del suo cromosoma coinvolge anche quello di origine virale. Nel momento in cui si creano le condizioni per l'escissione del cromosoma del fago da quello batterico, si entra nel ciclo litico.
        
        BATTERIOFAGI TEMPERATI:
        Sono i fagi che possono scegliere se intraprendere il ciclo litico o il ciclo lisogeno in base alle condizioni.
- - - - INDUTTORE:
        La molecola che determina l'attivazione genica, fa parte della classe degli effettori che partecipano al controllo dell'espressione di molti geni regolati.
        Il fenomeno per cui si ha l'espressione genica di un gene in risposta ad un induttore è definito induzione.
      - IL LATTOSIO COME FONTE ENERGETICA:
        Se a E.Coli viene fornito come fonte di carbonio il lattosio, al posto del glucosio, viene immediatamente sintetizzato un certo numero di enzimi necessari per metabolizzarlo. Gli enzimi sono un prodotto della trascrizione di geni regolati, necessari solo in determinati momenti, che non verrebbero trascritti nella situazione in cui nella cellula ci fosse anche glucosio.
        
        I PRODOTTI DELL'ESPRESSIONE DELL'OPERONE LAC:
        Quando il lattosio deve essere metabolizzato, vengono sintetizzate tre proteine:
        
        La Beta-galattosidasi, enzima che catalizza la scissione del lattosio in glucosio e galattosio e l'isomerizzazione del lattosio ad allolattosio;
        
        La lattosio permeasi che si trova nella membrana citoplasmatica ed è necessaria per il trasporto attivo del lattosio all'interno della cellula;
        
        La Beta-galattosidasi-transacetilasi di cui la funzione è però poco chiara.
      - STRUTTURA DELL'OPERONE LAC:
        L'operone Lac è costruito in ordine da: Promotore, Operatore e Geni strutturali.
        A monte di questi, adiacente al promotore, vi è il gene regolatore Lac I.
        
        MUTAZIONI CHE ALTERANO LA REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA
        
        MUTAZIONI DELL'OPERATORE (CIS-DOMINANTE):
        Le mutazioni nell'operatore furono chiamate mutazioni costitutive dell'operatore o lacOc. Questo tipo di mutazione altera le coppie di basi nella sequenza di DNA dell'operatore e lo rendono irriconoscibile da parte del repressore. L'alterazione è a carico solo dei geni a valle della stessa molecola di DNA secondo il modello della Cis-Dominanza in quanto non codifica per un prodotto diffusibile e in una situazione di diploidia parziale il gene a valle di un operatore non mutato è soggetto ad un normale controllo inducibile.
        lacO+, lacZ-, lac Y+
        /
        lacOc, lacZ+, lacY-
        La beta-galattosidasi è espressa in modo costitutivo mentre la permeasi è soggetta ad un normale controllo inducibile.
        
        MUTAZIONI DEL GENE REGOLATORE LACI (TRANS-DOMINANTE):
        In un diploide parziale in cui uno dei due geni regolatori è mutato, la risposta alla presenza o assenza dell'induttore è corretta. Questo significa che il gene lacI+ può compensare e dominare l'effetto dovuto alla mutazione lacI- e che si tratta di un gene trans-dominante. Gli operoni sono inducibili.
        lacI+, lacO+, lacZ-, lacY+
        /
        lacI-, lacO+, lacZ+, lacY-
        
        SUPER-REPRESSORE LacIs (TRANS-DOMINANTE):
        Nei diploipdi parziali LacI+ / LacIs l'allele LacIs è trans-dominante perché codifica per il repressore diffusibile che può legarsi all'operatore ma non è più in grado di riconoscere l'induttore allolattosio e quindi non si stacca più..
        
        DOMINANZA NEGATIVA LacI-d (TRANS-DOMINANTE):
        Nei mutanti lacI-d le subunità di repressore non si combinano normalmente, non si forma un repressore funzionale che si attacchi all'operatore e l'espressione è costitutiva. Nei diploipdi lacI-d/lacI+ vi è una miscela di polipeptidi normali e mutanti che si possono combinare casualmente a formare il tetramero: la presenza di una o più subunità difettive all'interno di questo è sufficiente per bloccare il normale legame con l'operatore. Quindi la mutazione lac-d, pur essendo loss-of-function, produce un fenotipo dominante
        
        MUTAZIONI NEL PROMOTORE (CIS-DOMINANTE):
        Dato che il promotore è la sequenza riconosciuta dall'RNA polimerasi e non codifica per alcun prodotto, l'effetto di una mutazione su di esso è limitato ai geni che esso controlla sullo stesso filamento di DNA: si tratta di un gene cis-dominante.
        
        MODELLO DI FUNZIONAMENTO DELL'OPERONE:
        
        Il gene per il repressore lacI+ è trascritto in modo costitutivo e la traduzione del suo mRNA porta alla sintesi di un polipeptide di 360 amminoacidi. Quattro di questi polipeptidi si associano a formare un tetramero, che costituisce la proteina repressore Lac funzionale. Il repressore si lega all'operatore lacO+ nella stessa sequenza che occuperebbe la RNA polimerasi, per cui, quando è presente, la trascrizione non è possibile e si dice che l'operone lac è sotto controllo negativo;
        
        Quando E.Coli selvatico cresce in presenza di lattosio come unica fonte di carbonio, parte del lattosio viene convertita dalla beta-galattosidasi in allolattosio che si lega al repressore e ne modifica la conformazione in modo che non possa più occupare l'operatore: in questo modo l'induttore induce la produzione di enzimi che lo degradino.
        
        Un basso livello di trascrizione dei geni determina la presenza di alcune molecole dei tre enzimi anche in assenza di induttore; ciò avviene perché i repressori non si legano in modo stabile e nei brevi istanti in cui si stacca e prima che un altro si leghi, l'RNA polimerasi può iniziare la trascrizione. In questo modo è permesso l'iniziale trasporto di glucosio all'interno della cellula e la conversione del lattosio in allolattosio.
    - - STRUTTURA DELL'OPERONE TRIPTOFANO:
        Nell'operone trp vi sono cinque geni strutturali denominati con le lettere dell'alfabeto dalla A alla E, il promotore e l'operatore sono a monte del gene trpE.
        Tra la regione operatore, promotore e trpE vi è una corta regione detta trpL o regione leader, all'interno della quale vi è un sito attenuatore che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'iperone trp.
      - REGOLAZIONE DELL'OPERONE TRIPTOFANO
        
        ESPRESSIONE IN PRESENZA DI TRIPTOFANO:
        Il gene trpR, localizzato ad una certa distanza dall'operatore, codifica per una proteina aporepressore, un repressore inattivo incapace da solo di legarsi all'operatore. Affinché si attivi a svolgere la sua funzione, necessita del legame con il triptofano che si comporta quindi da effettore. A questo punto può legarsi all'operatore e impedire l'inizio della trascrizione dei geni che codificano per la biosintesi del triptofano.
        
        ESPRESSIONE IN PRESENZA DI BASSE CONCENTRAZIONI DI TRIPTOFANO:
        Vi è un meccanismo che consente di gestire le situazioni in cui vi è bassa o nulla concentrazione di triptofano, che si basa sul controllo dell'entità dei trascritti. La quantità di trascritti completi che includono i geni strutturali, è inversamente correlata alla quantità di triptofano presente nella cellula. Vi è perciò un meccanismo, detto di attenuazione che può far variare la trascrizione dell'iperone trp dalle 560 alle 700 volte.
        
        MODELLO MOLECOLARE DELL'ATTENUAZIONE:
        Il trascritto dell'mRNA della regione leader trp L include una sequenza che può essere tradotta per produrre un corto polipeptide; subito prima del codone di stop di tale sequenza vi sono due codoni adiacenti per il triptofano che svolgono un ruolo centrale nell'attenuazione, questa corrisponde alla regione 1. Al di là del codone di stop si susseguono poi altre tre regioni che possono piegarsi e formare strutture secondarie per appaiamento di basi complementari; bisogna tenere conto che in organismi procarioti trascrizione e traduzione possono avvenire in modo accoppiato e che la traduzione può influenzare la trascrizione stessa:
        
        L'appaiamento delle regioni 1 e 2 dà luogo a un segnale di pausa nella trascrizione;
        
        L'appaiamento delle regioni 3 e 4 è un segnale di terminazione della trascrizione;
        
        L'appaiamento delle sequenze 2 e 3 è invece un segnale di anti-terminazione che permette il proseguimento della trascrizione.
        
        Se le cellule si trovano in carenza di triptofano, la quantità di molecole di tRNA corrispondenti all'amminoacido triptofano saranno poche e quindi il ribosoma che sta traducendo il trascritto della regione leader si fermerà in corrispondenza della regione 1: in questo modo le regioni 2 e 3 si appaieranno per complementarietà e avverrà il segnale di anti-terminazione.
        Se è presente una quantità sufficiente di triptofano il ribosoma può tradurre i codoni di Trp e proseguire fino al codone di terminazione del peptide leader: il ribosoma sarà posizionato in modo da coprire parte della regione 2 e quindi regione 3 e 4 potranno unirsi nella struttura che prende il nome di attenuatore e che fungerà da segnale per la fine della trascrizione, dato che la RNA polimerasi non riuscirà a proseguire oltre.