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06-05-23-GENÉTICA (NAIR)-SEQUENCIAMENTO, CRITÉRIOS ACMG - classificação…

- - - - artefatos de PCR
        
        UMI
        
        É um oligo que marca um DNA fragmentado
        
        Vantagem em biblioteca de PCR multiplex.
        
        Permite identificar se as variantes dos reads são artefatos de PCR (advem de uma única molécula) ou não são arfatos
        
        unique molecular identifier
      - cobertura
        
        variantes somáticas precisam ser sequenciadas muitas vezes, ou seja requer muito mais profundidade do que germinativos, pois é necessário uma sensibilidade muito elevada para determinar a porcentagem variantes tumorais.
    - - O painel de genes a ser sequenciado pode ser construído por duas formas: usar sondas para capturar os alvos ou fazer uma PCR multiplex que tenham alvos para todos os genes.
      - Captura por sondas requer uma hibridização
      - PCR MULTIPLEX: Um problema é que alguns genes não tem eficiência de amplificação, então é necessário colocar mais primer ou sequenciar mais vezes essa amostra
      - SONDAS: Um problema é que pode haver off-target, ou seja, podem ser processados e sequenciar coisas que não serão analisadas.
      - INDEXAÇÃO: O p5 é um adaptador. O index próximo ao p5 é chamado de i5. O p7 é outro adaptador. O index próximo ao p7 é chamado de i7.
    - - concentração em ng,ul/660 g/ (tamanho médio do nucleotídeo) x tamanho médio do par de base da biblioteca
      - Quantificação pode ser por Qubit ou qPCR
        qPCR é usado para quantificar bibliotecas problemáticas (as vezes são formadas bibliotecas com os adaptadores mal formados e que não serão indexados. Pode influenciar na molaridade final do sequenciamento.
    - - Gráfico de ocupação
      - % que passaram no filtro e c/ % de ocupação
    - - Ciclos de reads
        
        No ciclo n, entra uma base, emite a fluorecencia e o equipamento tira foto do cluster.
        
        Após ler, durante as lavagens os clusters são convertidos a nucleotídeos normais, e o cluster fica pronto para o próximo dideoxinucleotídeo incorporar na cadeia
      - Ion
        
        PCR em emulsão (análogo a clusterização)
        
        Cria uma bolha de emulsão contendo uma esfera com oligo
        
        Bolha pode ficar sem nada, com único molecula (ideal), com duas moléculas (policlonal, não ideal, e que não fará parte dos dados do sequenciamento)
        
        Cada ciclo, é colocado uma base, quando o poço acidifica, é detectado qual a base foi adicionada.
      - Reads longas
        
        DNA: usado para verificar regiões repetitivas, pseudogenes, haplótipos. RNA: fusões variantes de splicing, transcritos alternativos
        
        Nanopore e Pacbio sequenciam reads longas
- - - - É uniforme quanto todas as regiões sequenciadas tem pelo
        menos um X de cobertura. As vezes, há regiões que não ficam cobertas.
      - Planejar cobertura
        
        Ver se outpupt do sequenciamento é adequado
        
        Definir o tamanho do painel
        
        Verificar nas especificações do painel comercial quanto dado gera, ou calcular multiplicando o tamanho de todas as regiões envolvidas no sequenciamento
        
        Definir a média de cobertura desejada (se será somático ou germinativos)
        
        germinativo
        
        20x para exoma / genoma
        30-50x paineis pequenos
        
        somático
        
        no mínimo 500x
- - - - ACGS é uma entidade européia de classificação que possui estratificações para as variantes de significado incerto - quente, morna, fria.
- - - - Há mais afetados do que se espera na população
        Variante tem frequência maior do que se espera para a doença (indicativo de que variante é benigna (depende da frequência)
    - - Variante está presente em indivíduos adultos saldáveis (gnomad, NIH) (depende de número absoluto
    - - É uma variante com frequência alélica maior que 5%, são removidas pelo hard filter do pipeline. Por si só classifica variante como benigna. (há uma lista de excessão). É suficiente para encerrar a classificação.
  - - - pLI - prox 1 ( )
        LOEUF prox 0 ( indicativo de que a variante com perda de função pode ser deletéria pois são pouco representadas; genes intolerantes a variantes )
  - - - variante não é deletéria in silico usando preditores
  - - - Avaliar tamanho da região acometida. pois mesmo perdendo um aminoácido, caso a região seja grande pode não haver perda de função. Então se considerar-se que não haverá perda significativa pode ser aplicado um PM4_suporte
  - - - variante descrita como patogênica, e paciente possui variante de nucleotídeo diferente mas que leva a mesma produção de aminoácido já descrita como patogênica, então sera patogênica PS1
    - - Pega uma variante já descrita como patogênica e aplica mesmo se naquela posição a variante encontrada no paciente for outra.
- - - - Contamos apenas os exons; a posição 1 é o ATG que inicia a tradução
      - INTRON - há uma convensão para descrição deles
        
        Precisa usar o exon de referência mais próximo para descrevê-lo
        
        (13 +1) (a primeira base após a base 13 do exon, é um intron)
        
        (20 -1) (a última base antes do exon é um intron)
      - Tudo que estiver antes da porção codificante (5'UTR - ATG) recebe sinal de negativo (-)
        p.ex. - 1
        Tudo que estiver após a porção codificante (3' UTR) recebe sinal de asterisco (), ou seja, tudo que vem depois do stop codon.
        p.ex 10 (dez nucleotídeos após o stop codon)
      - É essencial possuir o identificador do transcrito para fazer as análises.
      - proteínas - p.
        
        Cada códon do DNA codificante é uma posição (ATG), se torna 1 (met).
    - - Contém sequências tanto de éxons e introns (não usar para descrever dna codificante
    - - A mesma referência pode conter informações de um gene em diferentes sentidos. Tanto no sentido sense como antisense. Para definir qual o sentido será usado é necessário avaliar onde é o início do gene para começar a referenciar
      - Regra 3' para regiões repetitivas
        
        Para indels em regiões repetitivas (ex. AGGGT), descrever que a indel está o mais 3' linha possível(ex. deleção de G, descreveria como g.4delG) esta regra não pode ser seguida em caso de junções exon exon.
        
        3' ACCCCGTACATTGCAAT 5'
- - - - Casos clínicos
        
        CASO 1
        
        Síndrome de knobloch (miopia, degeneração de retina, encefalocele - protuberância no osso ocipital)
        
        mutação homozigota no braço longo do cromossomo 21 no gene do colágeno. (ambos alelos estão mutados com a mesma mutação)
        
        mutação pontual que fazia com que o exon 2 não fosse unido aos demais exons. Há uma mutação na borda exon intron. Exon 1 colava direto com exon 3, gerando mudança da fase de leitura e parada da prematura na transcrição do exon 4. Não criava colágeno 18.
        
        Doença autossômica recessiva: Não ocorre nos heterozigotos e precisa ter afetado com dois alelos mutados para expressar a doença. Chance de recorrência de 25% para pais heterozigotos.
        
        FENOCÓPIA - Fator ambiental que simula uma doença genética. As vezes o indivíduo apresenta uma condição que simula muito uma doença genética.
        
        DOENÇA A. RECESSIVO: Em um unico gene um indivíduo pode apresentar mesma mutação no mesmo alelo homozigoto ou mutações diferentes no mesmo alelo heterozigoto composto
        
        CASO 2
        
        Fibrose cística
        
        Glândulas exócritas produzem secreções espessas
        
        Mutações patogênicas no gene CFTR que codifica uma proteína transmembranar que forma um canal de cloreto na célula.
        
        Possui mais de 1.700 variantes patogênicas no gene CFTR, heterogeneidade genética
        
        DOENÇA A. RECESSIVA No paciente estudado havia ambos alelos mutados, porém, mutações diferentes. ou seja, um heterozigoto composto
        
        Precisa sequenciar os pais para saber se variante está em um alelo ou em alelos diferentes
        
        Há fármacos para cada tipo de mutação
        
        Possui heterogeneidade alélica a mesma doença pode ser causada por diferentes mutações num mesmo gene.
        
        CASO 3
        
        SURDEZ CONGÊNITA
        
        A.RECESSIVA
        
        Gene da ortofelina, Gene da ortofelina, alteração recessiva em cada um pode gerar o mesmo fenótipo (exemplo de heterogeneidade in loco)
        
        CASO 4
        
        ACONDROPLASIA
        
        A. DOMINANTE Todos os afetados tem progenitores afetados. É expressa nos heterozigotos. (geralmente os homozigotos dominantes (AA) são muito graves e tem morte fetal).
        
        Maioria tem mesma mutação no FGFR3 (receptor de fator de crescimento de fibroblasto). o receptor de FGF sinaliza formação de cartilagem e ossos longos. Mutação missence faz com que haja ganho de função. Receptor é muito ativado e faz com que o osso não cresça (cartilagem não cresce e vira osso muito rápido).
        
        Só 10% dos casos são filhos de pais acondroplásicos
        
        90% são casos de mutação nova, principalmente, por idade paterna avançada.
    - - Expressividade (variação de fenótipos entre indivíduos) na acondroplasia, é não variável. Praticamente todos tem o mesmo fenótipo.
    - - Há alterações no crânio e na face (mutação é no gene TCOF1)
      - A DOMINANTE
        
        Filhos afetados de pais afetados
        
        Penetrância é completa - tem mutação tem sinal da doença
        sempre
        
        expressividade variável - o mesmo genótipo pode causar várias manifestações diferentes
        
        haploinsuficiência - alelo mutado não funciona e alelo funcional não é suficiente para compensar a falta da ação do alelo mutado.
    - - NEUROFIBROMATOSE TIPO I
        
        É A. DOMINANTE
        
        Muitos tecidos podem ser afetados negativamente pela mesma mutação no gene EF1 efeito pleiotrópico
        
        penetrância é completa - Tem mutação e tem sinall
        
        expressividade é variável - pessoas com mesma mutação podem ter manifestações diferentes.
    - - Retinoblastoma
        
        A. DOMINANTE
        
        Há perda de função no gene RB1 - haploinsuficiência
        
        penetrância é incompleta - mesmo com a variante, a pessoa pode não ter nenhum sintoma na rotina
    - - Distrofia muscular de Duchenne
        
        Todos os homens filhos de mulheres com mutação tem a doença.
        
        doença é ligada ao X, recessivo
        
        Há 25% de risco de ter filho doente e, dentre filho homem, risco é 50%
        
        Há variante deletéria no gene DMD - codifica distrofina e está localizado no cromossomo X
        
        Exceção são mulheres que tem problema na inativação do X e inativam o X normal, levando a doença de duchenne
    - - HEMOFILIA A
        
        recessiva ligada ao X - mais comum em homens, mas também pode ocorrer em mulheres (neste último caso, para a mulher ter a doença precisa ser filha de um pai com hemofilia e de uma mãe heterozigota.
        
        Mutação no gene F8 que codifica o fator 8 (braço longo do cromossomo X)
        
        Ausência de transmissão de homem para homem
    - - HIPOFOSFATEMIA
        
        Ligada ao X
        
        DOminante ligada ao X
        
        Ausência de transmissão de filho para pai
        
        Todas as filhas do mesmo pai tem alteração (recebem o X mutado)
- - - - aditivas
      - epistasia
        
        gene que inibe a expressão de outro
      - dominância
    - - Cada alelo que contribui para o fenótipo é chamado de alelo de suceptibilidade
      - Pais de meninas com autismo tem mais risco de terem filhos com autismo pois a carga gênica de alelos de risco precisa ser maior para uma menina nascer afetada.
        
        Também existem autismos monogênicos
      - Doenças multifatorial tendem a ser comuns na população.
      - doenças complexas podem ter vários tipos de padrões de herança como monogênica e multifatorial. Ex: Alzheimer, esquizofrenia
      - Já a herança poligênica se vêm da influência apenas de vários genes
      - herdabilidade valor de 0 a 100 que mostra o quão preponderante a genética é preponderante para a população ter uma doença.
      - estudo de associação de SNPs - variantes únicas
        
        Polimorfismo: variante com frequência maior que 1% na população
        
        GWAS
        
        Sistema de associação global
      - Tipos de variantes
        
        SNV - variante de nucleotídeo único
        
        SNP - polimorfismo de nucleotídeo único
      - O modo de avaliar essas heranças multifatoriais é realizar estudos de associação, ou seja, analisar grupos que contém a doença e investigar se possuem variantes em comuns
      - Doenças complexas
        
        Fissura lábio palatina, cardiopatia congênita, espinha bífida,
        transtornos neuropsiquiátricos, altismo, alzheimer, hipertensão arterial.
        
        Se poligênica é difícil estabelecer chance de recorrência: os números dos loci são desconhecidos, o genótipo dos pais é desconhecido, fatores ambientais são variáveis
        
        Inicialmente pode-se avaliar se há alguma variante que é monogênica (CGH-array ou Exoma) na pessoa, se há outros membros afetados na família.