Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Material&Method, data set - Coggle Diagram

- - - - 따라서 본 논문에서는 3가지 다른 농도에 대한 표준 DNA 증폭 실험에서 well간 편차로 인한 정량 분석 오류를 줄이기 위해 증폭 곡선의 equalization 방법 3가지를 제안한다.
  - - - 따라서 모든 well들의 형광 강도값이 임의의 한 well 에 대해 모두 선형적인 관계를 갖는다면 해당 식으로 modulation 이 가능하다.
        
        Equation 1
        
        $$data_i = rawData_i * gain_i (where : i is 1 to 25)$$
        
        각 well에서 취득된 raw 형광신호(rawData_i) 는 형광 신호를 향상시키기 위한 gain 파라미터(gain_i) 와 곱해져 equalization 될 수 있다.
        
        따라서 본 논문에서는 선형적인 형광신호 향상을 위한 gain 파라미터 생성 방법 두가지를 제안한다.
        
        method 1
        
        각 well 의 gain 파라미터를 구하기 위해
        
        모든 튜브들이 실제로 같은 밝기를 갖고 있을때 각 well들의 형광 강도값 편차를 측정하기 위해 형광 시약 실험을 진행하였다.
        
        750femto의 FAM 단일 형광시약이 25개의 튜브에 들어있으며, 5 set로 실험하였다.
        
        5번 실험 결과에 대한 i-th tube의 형광 영상 밝기 평균이 t_i 라고 하면 gain_i은 Equation 2 와 같이 계산된다.
        
        Equation 2
        
        $$gain_i = max(t_i) / t_i$$
        
        method 2
        
        표준 DNA 증폭 실험에서 fully-amplification 된 형광 밝기를 이용하여 gain 파라미터를 구하기 위해 증폭 곡선의 pleatue 구간의 밝기를 사용하였다.
        
        사용된 증폭 곡선은 가장 높은 농도인 10^-3 농도를 사용 하였으며, end-point(60cycle) 에서 얻어진 발기값이 증폭곡선 pleatue 구간의 대표값으로 선정하였다.
        
        Equation 2 를 이용하여 method 1과 똑같이 gain 계산 하였다.
  - - - Table 1
      - DNA
      - primer
      - master mix
      - DDW
    - - Table 2
    - - 사용 형광
        
        단일 형광(FAM)
      - cycle
        
        1~60 cycle(Pleatue 구간을 보기 위해)
      - DNA 농도
        
        10^-3, 10^-4, 10^-5 (10 Diluition, 세가지 농도)
  - - - Linear modulation 과 달리 형광 강도 값이 임의의 한 well 에 대해 각각 다른 비선형적인 관계를 갖는다면 equalization는 Equation 3 와 같다.
        
        Equation 3
        
        $$data_i = E_i(rawData_i)$$
        
        따라서 각 well의 비선형 equalization 함수 E_i 를 구하기 위해
        
        같은 농도의 증폭 곡선이 해당 cycle에서 같은 밝기를 갖고 있을 것이라 가정하고
        
        기준이 되는 well에 대한 다른 well들의 transform 함수를 구하기 위해 curve fitting을 진행하였다.
        
        curve fitting 함 수는 Equation 4를 사용하였다.
        
        Equation 4
        
        1 more item...
        
        기준이 되는 tube는 광원과 가장 가까운 12번 tube로 선정하였다.
- - - - FAM, HEX 는 Green 채널 그리고 ROX, CY5 는 Red 채널로 조사되었다.
    - - 튜브 중심점 -> Optical system
  - - - 해당 장비는 모든 실험에서 tube loading 과정이 필수적이기 때문에 이미지 안 튜브들의 위치가 바뀔 가능성이 있다.
        
        따라서 이미지 안의 각 tube-window 영역을 결정하는 것은 중요하며, 이는 형광 data variation의 원인 요소에 포함될 수 있다.
        
        system 마다 공차
        
        tube loading error는 무시할 만 하다
    - - Figure 2
        
        a
        
        ShadingCalibration.docx 의 2. Window center finding
        
        a, b change
        
        b
        
        ShadingCalibration.docx 의 1. Tube-grid finding
      - Figure 2 a 는 튜브의 영역을 구하기 위해 window 부분의 edge를 사용하는 window center finding 알고리즘이다.
        
        튜브 이미지 내의 edge를 구하기 위하여 DoG(Difference of Gaussian) filter를 이용하였다.
        
        가우시안 필터의 표준 편차는 각각 5, 7을 사용하였다.
        
        원본 영상에서 Otsu threshold 알고리즘으로 튜브의 전체적인 형상을 구한 뒤 erosion 연산을 통해 전체 튜브 테두리를 제외한 mask를 구했다.
        
        DoG filter를 적용한 결과에서 mask에 포함된 영역만 p-tile threshold 알고리즘으로 1%의 tube-window edge만 추출했다.
        
        마지막으로 Hough circle 변환 알고리즘을 통하여 tube-window 영역을 구할 수 있었다.
      - Figure 2 b 는 window center finding 알고리즘의 복잡함을 단순화 하고자 Tube-grid finding 알고리즘이 만들어 졌다.
        
        원본 이미지에서 x, y 축으로 projection 연산 후 생성된 projection 신호로 부터 각 5개의 peak를 검출 한다.
        
        좀 더 robust한 peak 검출을 위해 median filter가 적용되었다.
        
        최종적으로 첫번째 튜브의 중심점 위치와 x, y 축에 대한 tube interval 이 저장되어 형광 검출에 사용된다.
      - 두 알고리즘은 후에 기술될 형광 시약 실험과 증폭 실험 이미지에서 pixel 단위로 center 값을 구한 후 실제 물리적 거리로 계산되어 변동을 확인하였다.
      - RoI -> Optical window 용어 통일
        
        Optical window 구하기 위
- - - - b
      - a
    - - 열 순환 시스템은 본 연구팀이 보유하고 있는 conventional PCR을 위해 개발된 열 순환기를 사용하였다.
        
        chamber heater
        
        Chamber heater는 heating block, peltier 열전 소자, heat sink 그리고 fan으로 구성되며 수직으로 배치된다.
        
        Heating block은 열 전도율을 고려해 알루미늄 소재로 제작되었으며, 25-well(5 by 5)들을 포함하는 형태로 디자인 되었다.
        
        lid heater
        
        Lid heater 는 튜브안 시약의 증발을 방지하기 위한 역할을 하며, chamber heater 위에 배치된다.
      - 해당 열순환기는 모든 웰의 온도 균일성을 유지하며 PCR 온도 프로토콜을 수행할 수 있음이 보고되었다.
      - 광학 시스템과의 통합 과정에서 chamber loading 과 튜브 뚜껑과 Lid heater의 접촉을 위한 linear servo motor가 각각 사용되었다.
    - - 다중 형광 검출을 위한 광학 시스템은 Figure 1 b 와 같이 구성되어 있다.
        광학 시스템은 열순환기 위에 수직으로 배치되어 실시간 PCR의 온도 프로토콜 수행중 각 cycle마다 각 well의 형광을 측정한다.
        
        Camera module
        
        형광 검출 시스템의 소형화와 저비용을화를 위해 스마트폰에 사용되는 CMOS 카메라 모듈을 사용하였다.
        
        카메라 모듈은 이미지 센서 Sony IMX298을 포함하고 있으며, USB(Universal Serial Bus) 통신을 지원하여 취득된 이미지를 호스트에서 처리 가능하다.
        
        Light source
        
        광원으로 하나의 white LED를 사용하며, 카메라와 완전히 수평으로 위치하는 것이 불가능 하고 튜브 뚜껑의 반사광을 방지하기 위해 45도 방향으로 4.5mm의 오프셋을 주어 위치되었다.
        
        Filter wheel
        (emission/excitation filters)
        
        Filter wheel은 다중 형광 촬영을 위해 linear stepper motor로 제어되며, motor homing을 위한 자석, 4개의 형광(FAM, HEX, ROX, CY5)에 대한 emission 과 excitation filter가 포함되어 있다.
        
        Fresnel lens
        
        White LED가 25개의 well들을 모두 균일하게 조사하고, 이미지 내의 영상 왜곡을 방지하기 위해 프레즈넬 렌즈가 사용되었으며, 초점 거리에 맞게 lid heater와 filter wheel 사이에 배치되어 있다.