Paso 3: La fructosa 6 fosfato gana un segundo fosfato que proviene de otro ATP, el fosfato añadido se une al primer carbono produciendo fructosa 1,6-bifosfato, osea fructosa con fosfatos en las posiciones 1 y 6. En el curso de las reacciones que se han visto hasta aquí dos moléculas de ATP se han utilizado en generar un compuesto que será rápidamente degradado en las etapas posteriores, la enzima que cataliza este paso es la fosfofructoquinasa, es una enzima alostérica que inhibe su actividad, la interacción alostérica entre ellos es el principal mecanismo regulador de la glucolisis.
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