Analyse génomique

Introduction

Diffs analyses vont être liées aux diffs aspects de la génétique.

PCR se trouve à peu près entre la MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) et le séquençage en termes de résolu°. Cela va dépendre de la technique d'analyse. La CGH se trouve un peu plus vers l'échelle chromosomique que l'échelle molr.

Caryotype

But est de voir les grosses anomlaies, on regarde directement les chromosomes au stade métaphysique (mitose). On va pouvoir rechercher des anomalies de nombre ou de structure.

Condi° est de recueillir des cells vivantes car elles vont être capables de se diviser spontanément ou après stimula° par des mitogènes.

Pour ce qui est des tissus, on observe surtout de la moelle osseuse +++ mais on peut regarder aussi du sang (pour des LLC par ex) et on pourrait regarder un peu n'importe quel liquide du moment qu'il y a des cells dedans.

Sa résolu° est entre 3 et 5 Mb.

L'inconvénient est qu'il est long (mise en culture des cells nécessaires), sa résolu° est faible : on ne peut pas voir les petits réarrangements et le coût est quand même imp (même si ça tend à se réduire au fil des années).

L'avantage est qu'il apporte une vision globale, on peut voir les mécanismes de remaniement.

Une fois les métaphases repérées, elles sont observées avec un objectif de plus fort grossissement (x100) et au moins 20 mitoses sont sélectionnées pour l’établissement d’un caryotype.

Classement et analyse des chromosomes (x 20) : Bandes G ou Bandes R.

Classement et analyse des chromosomes se fait suivant leur taille, leur banding (bandes présentes sur le chromosome) et leur index centimérique (métacentrique = centromère au milieu, submétacentrique = un petit peu plus au-dessus et acrocentrique = tout en haut).

Indice centromérique = endroit où se trouve le centromère.

Sur un caryotype, observa° des anomalies de nombre :

  • Perte de chromosome : monosomie.
  • Gain de chromosome : trisomie ou +.

Observa° d'anomalies de structure :

  • Transloca° : équilibrée ou déséquilibrée.
  • Délétion.
  • Insertion.
  • Inversion.
  • Autres : marqueurs, anneau, chromosomes double minute.

Chromosome double minute = petits fragments de chromosomes qui vont être là en plus des chromosome habituels mais qui ne sont pas vraiment de chromosomes à part entière.

FISH

Biologie moléculaire

Intérêt des analyses génomiques en hémopathies malignes

Exemples d'altéra° géniques en hémopathies malignes

Conclusion du cours

Principe est d'utiliser des sondes qui sont des petits fragments d'ADN marqués avec un fluorochrome qui vont pouvoir s'hybrider.

La lecture se fait au microscope à fluorescent et la résolution est d'environ 150kB : c'est plus fin que le caryotype mais ce n'est pas encore optimal.

Présente qq inconvénients comme les petites duplica° côte à côte qu'on ne peut pas voir ou encore le temps de culture nécessaire. L'avantage est qu'on va voir des mécanismes de remaniements, des amplifica°, des délé°.

Diffs types de sonde :

  • Sondes à chromosome entier (peinture) qui ne sont pas très utilisées.
  • Sondes à séquences répétées pour voir uniquement les centromères qui ne sont pas très utilisées non plus.
  • Sondes à séquences monologues : les plus utilisées notamment pour cibler particulièrement un gène : Sondes de sépara° (break apart) et Sondes de fusion.

Sondes de peinture : Au départ on a un chromosome entièrement rouge et un chromosome entièrement vert. On obtient un chromosome vert avec du rouge au bout et un chromosome rouge avec du vert au bout : il y a donc eu une transloca° entre les 2 chromosomes.

Sondes monolocus

Sondes break apart : On a 2 sondes : une verte et une rouge. Elles vont être posées côte à côte : si on regarde au microscope à fluorescence on voit 2 points jaunes car en optique vert + rouge = jaune. Si on a une transloca°, une coupure dans le gène ou un réarrangement, cela va séparer les 2 sondes et on aura donc un point rouge et un point vert (cela nous prouve que le patient est muté).

Sondes de fusion : Le principe est totalement l'inverse des sondes break apart : on a 2 sondes placées à des endroits diffs par ex ici une sur le gène BCR (chromosome 22) et une sur le gène ABL (chromosome 9) donc en théorie on devrait avoir 2 points rouges et 2 points verts. Si on a une transloca° 9;22 et donc une fusion BCR/ABL on va avoir un point vert, un point rouge et un point jaune.

Repose sur l'amplifica° d'acides nucléiques : soit ADN avec la PCR, soit ARN avec la RT-PCR (Retro-Transcription PCR qui est à ne pas confondre avec la Real Time PCR).

Si on souhaite avoir une détec° quantitative on va faire de la qPCR (q pour quantitative) ou de la RT-qPCR pour voir des réarrangements chromosomiques, des muta° ou des expressions aberrantes d'oncogènes (ex de la surpression de la WT1 ou de la cyclise D1).

Intérêt est de permettre de faire des diagnostics et de classifier les diffs pathologies notamment maintenant grâce à la documenta° de l'OMS de 2016 dans laquelle on va avoir une classifica° qui va se faire par anomalie génétique directement.

Certaines anomalies chromosomiques et/ou molrs sont donc caractéristiques d'hémopathies malignes : cas dans les leucémies aigues myéloïdes avec par ex la leucémie aigüe promyélocytaire (anciennement LAM3) qui va forcément présenter une transloca° t(15;17) PML/RARA.

Biologie molr va nous donner un aspect pronostique et prédictif puisque le fait que certaines muta° soient présentes va nous permettre de savoir si le pronostic va être favorable ou défavorable. Par ex une surpression de WT1 va être défavorable et une surpression NPM1 va être favorable.

Permet de voir s'il y a des thérapies ciblées qu'on peut mettre en place. La muta° PML/RARA, si on reprend l'ex de la leucémie aigüe promyélocytaire, se traite très bien avec de l'acide tout-transrétinoïque. Sans acide tout-transrétinoïque le patient peut mourir en une semaine alors qu'avec, le patient survit des années.

En plus de cela, la biologie molr permet un suivi de la maladie résiduelle : ex de la LLC qui est l'ex le plus parlant car les biologistes s'en occupent très souvent, ils vont suivre le transcrit de fusion BCR/ABL et cela va permettre de savoir si le patient est en rémission ou non.

Il peut y avoir des transloca° chromosomiques qui vont provoquer des hémopathies malignes selon diffs mécanismes :

  • Créa° d'une prot de fusion proto-oncogène (comme dans la LLC avec BCR/ABL).
  • Séquence en amont d'un gène qui va provoquer une surpression de celui-ci (comme WT1).

Ex du MCL et cycline D1 : Dans le cas d'un MCL, on a une surpression de la cycline D1 à cause d'une transloca° t(11;14).

La petite séquence qui est sensée promouvoir le gène IGH (chromosome 14) va se retrouver en amont du gène de la cycline D1 (chromosome 11) et va provoquer sa surpression. L'anomalie est visible au caryotype.

Ex de PMR/RARA : Dans le cas d'une leucémie aigüe promyélocytaire, on a une transloca° t(15;17). Il existe un ttt spécifique avec un protocole sans chimiothérapie évoqué tout à l'heure : l'acide tout-transrétinoïque associé à de l'arsenic.

Analyse d'anomalies géniques est aussi une technique incontournable surtout pour les LA, notamment pour un diagnostic précis de la pathologie, pour le pronostic et pour le suivi de la maladie résiduelle.

Ces diffs analyses sont donc indispensables et complémentaires et permettent la classifica°, le diagnostic, le pronostic et la théranostique (thérapies ciblées).

L'immunophénotypage par CMF est un technique qui va être essentielle pour l'explora° des cells blastiques ainsi que les cells lymphoïdes matures en proliféra° donc tout ce qui est néoplasmes lymphoïdes et LA. Cette technique est aussi indispensable pour caractériser leur stade de matura°, pour le diagnostic et pour le suivi de la maladie résiduelle.

À savoir pour les EDN cf ronéo page 25