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DNA技術, 4.將重組DNA轉導入宿主細胞, 多型性, 限制酶片段長度多型性（Restriction fragment length…

- - - - 無法評估蛋白質的表現量
    - - 無法偵測基因的表現量
- - - - 桑格法/雙去氧鏈終止法
        
        螢光原位雜合技術（FISH）
        
        霰彈槍定序法（Shotgun sequencing）
        
        缺點:低估有重複序列者(真核生物)的基因組大小
        
        定序反應的核心就是其使用的ddNTP：由於缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。
    - - 次世代定序（Next Generation Sequencing, NGS）
        
        藉由同時間大量的短序列片段（Short Reads）定序達成高速以及高通量的效果，且樣品不需經質體複製就能進行定序，減少了複製過程可能出現的錯誤率。
        
        臨床上快速鑑定病原菌種：蛋白質質譜儀、專一
        性抗體ELISA檢測，次世代定序速度不夠快
    - - 第三代定序(Third Generation Sequencing,TGS)
  - - - DNA條碼(DNA Barcode)
- - - - 質體(Plasmid)：原核細胞中除了染色體DNA外所存在的環狀DNA
        
        A.具有獨立的複製起始點(ori序列)。
        
        B.多種限制酶酵素切位(Multiple cloning site；簡稱MCS)
        
        C.序列中含有選擇性標記基因(selection marker)，可幫助篩選。
    - - 噬菌體(Phage)
    - - 酵母菌人造染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)：真核生物載體，有端粒及中節區域，屬於染色體層級載體，此類載體有助於大規模研究基因圖譜。
  - - - 白色具有抗藥基因
    - - ISH的原理其實和南方墨點法（Southern blotting）類似，都是利用核酸序列會互補的特性來設計探針（probe）去標定互補（Complementary）DNA或RNA。
        雜合探針不會使用一般聚合酶連鎖（PCR）反應中使用的核糖核苷三磷酸（ribonucleoside triphosphate；rNTP），而是會使用具有放射性、螢光或是抗原標定過核醣核苷三磷酸。
  - - - 甲基化序列的Ａ跟Ｃ可防止被限制酶切割
      - blunt end
      - sticky end
- - - - Cre-Lox重組
        
        對一段特定的DNA（loxP序列，兩端為迴文序列）進行定位，並用Cre重組酶對其交集的DNA進行剪接，如：刪除、插入、轉座和倒位操作。
      - 類轉錄活化因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）
        
        由專一性的TALE DNA 結合結構域與非專一性的Fok I DNA切割結構域融合而產生的人工限制酶（artificial restriction enzyme）。
      - CRISPR/Cas9
        
        CRISPR
        
        外來的質體或病毒（噬菌體）DNA首次進入細菌後並未被完全分解，經加工後可嵌入細菌基因體而被稱為 CRISPR 陣列（array），可轉錄mRNA
        
        Cas9
        
        Cas9是能利用 mRNA 片段去辨認互補性的 DNA 片段，並切除符合序列的限制內切酶
        
        Cas9 蛋白質則會辨認 protospacer 序列鄰近的區域（protospacer adjacent motif, PAM）上游 3 個核苷酸的位點，利用核酸內切酶使標的 DNA 產生雙股斷裂（double-stranded break, DSB）。
        
        單股導引 RNA （single-guiding RNA, sgRNA）會與宿主特定的 DNA序列及Cas 9蛋白結合， sg RNA 的 protospacer 序列（17－20 個核苷酸）負責辨識專一性的 DNA 序列
        
        改 sgRNA 序列，即可改變 Cas9 蛋白的專一性，使其裁切另一不同序列的 DNA。
    - - 同源重組(Homologous recombination)/同源重組修復(homology-directed repair)