Méthode de séparat° + analyses des macromol bio
chromatographie
permet purificat° mol (séparer sub)
de partage : mol hésite
grpe carboxylique va se partager entre COO- et NH pr faire augmenter potentiel protons
HPLC : pompe pr augmenter débit d'élut°
= séparat° de mol par différences d'intéract° avc phase fixe et phase mobile
phase fixe
utilisat° support (poudre fine ou solide percé)
se crée interact° phy entre particules du support et sub à analyser
phase mobile
solvant doit solubiliser sub à séparer + circuler entre particules support ou microcanalicules
se crée intéract° phy entre solvant et sub à analyser
3 doivent interagir
solvant
sub
support
utilise propriétés
globales d'intéract° des prot
encombremt + taille = chroma exclus°-diffus° (tamis moléculaire)
intéract° spé avc ligant = chroma affinité
d'intéract° des AA
propriétés ioniques = chroma échangeuse ions
propriétés hydrophobes/hydrophyles = chroma phase inverse
100 % hydrophyle : diminuer hydrophyle pr augmenter hydrophobe
courbe élut° type
vol mort au tps mort = aucune intéract° spé = vol entre billes
pompe dt débit constant
si débit change : travailler uniquemt en vol d'élut°
si intéract° : s'accroche au support
pics
étroits = + facile à séparer
2 pics séparés = "efficace"
larges = risque de se chevaucher
paramètres
vit déplacemt solutés
facteurs de capacité
efficacité d'1 colonne tR = capacité de rétent°, capable de séparer 2 mol
résolut° d'1 colonne Rs
dépend degré élargissemt pic se produisant au fur et à mesure élut° (= effet dilut° du dépôt par diffus°)
dépend distribut° sub ds 2 phases
htr définie nbr plateau théorique N (nbr de séparat° théoriques)
élargissemt pic minimisé en réduisant granulométrie support (diminue surf d'intéract°)) compactage et diam colonne
= mesure quantitative capacité à séparer 2 sub A et B
= 2 [(tR (B) - tR (A) )/wA + wB]
w = oméga = largeur base pic
Rs>1,5 : séparat° complète
Rs = 1,5 : séparat° incomplète
Rs < 1,5 : mauvaise séparat°
ptt à ptt mol s'accroche, se décroche = équilibre à 50 50
élargissemt bande prot ds phase mobile due par différentes propriétés d'intéract° + diffus° prot
résolut° augmente avc lgr colonne
résolut° décroit avc phén diffus°
ê atténués par débit + vit phase mobile
plus colonne lg = + élut° grde
plateau théorique nul qd pas séparat°
joue sur élut° et sépararat° :
support polymère glucidique (dextran) lié par agarose avc sorte ramificat°, réalisant pores de tailles définies
prot de grde taille migrent rapidemt car exclus des pores ds vol mort
prot de ptte taille pénètrent pores support + migrent lentemt
séparat° en fonct° vol prot + capacité à utiliser vol pores
dès qu'on entre : commence diffus° occupant tt vol colonne
si ds condit° natives avc poids moléculaire:
jouer sur masses molaires et encombremt
plus ptt + avancer doucemt
servir à purificat°
pics séparés
droite étalonnage : poids moléculaire totalemt dénaturé
échangeurs ions = macromol insolubles portant grpmt ionisables ayant propriété échanger façon réversible crnts de leurs ions au contact autres ions provenant d'1 solut°
échangeurs cat° = chargé -
échangeur anion = chargé +
élut° = déplacer ion fixé par un autre de densité de charge et concentrat° + élevée
ptt ions fortemt chargé (Cl-, HO-, Na+, H+) ou variat° pH pr éliminer intéract° ioniques
capacité rétent° d'1 échangeur d'ions = nbr millimoles (mmol) d'ions que résine peut échanger par gr de résine sèche
élut° par compétit°
cat° monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
cat° divalent : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+
efficacité augmente avc charge : K+ < Ca2+ < Al3+
élut° par variat° de pH
si pH tampon utilisé pr chromatographie < au pI prot
= prot chargé + : utiliser échangeur cat°
pH tampon utilisé pr chromat > pI prot
= prot chargé - : utiliser échangeur an°
séparat° prot basée sur intéract° spé
prot ayant pas affinité pr ligand : éliminées lors lavage
ligand fixé par covalence au support inerte (pas réactif) via bras de fixat° = "spacer" permettant éliminat° contraintes stériques
élut° prot fixée réalisée
soit par compétit°
soit par variat° force ionique
soit par variat° pH
bras doit posséder réactivité chim aux 2 extrémités
fixat° suit équilibre format° du complexe
ex : P+L <=> PL
constante d'équilibre Ks = (P).(L)/(PL)
phase stationnaire = support macromol chimiquemt inerte (agarose-sépharose)
seule mom présentant affinité forte est retenue
obtenue par déplacemt équilibre liaison
par ligand libre en concentrat° élevée
par variat° pH
par variat° force ionique
pr fixat° effecteur à fonct° carboxyle
bras aminohexylique (spacer lg)
bras hydrazide (spacer court)
bras aminohexylique succinylée pr fixat° d'1 effecteur à fonct° -NH2 réactive (spacer lg)
électrophorèse
carte identité prot
poids moléculaire
pHi (pH où prot a charge nette nulle)
structure oligomérique
séparat° seulemt visuelle ms pas phy
= migrat° mol chargé ds champs électrique
forces accélérat° QX (charge mol Q champ électrique X) =F forces de frottemt V vit migrat°
si pas gel = pas frottemt
F : fonct° mol (encombremt) et milieu migrat° (viscosité)
encombremt imp pr forces frottemt
supports électrophorétiques
acides nucléiques : agarose (grosse maille) et polyacrylamide
prot : polyacrylamide = ptte maille
chargé - par phosphate
condit° électrophorèse + choix critères de séparat°
électrop native ou non-dissociantes basée sur encombremt = structure conformationnelle macromol reste sous forme native
migrat°selon charges intrinsèqyes prot (pH)
électrop dissociante basée sur taille (ou poids moléculaire) = structure conformationnelle macromol dénaturée
migrat° prot dénaturée en présence dénaturant (SDS) : prot chargé - de façon uniforme
prot : gel SDS (charges ajoutées)
acides nucléiques : gel urée (charges intrinsèques)
isoélectrofocailisat° basée sur pHi (dissociants ou non)
migrat° prot (dénaturée ou non) en foncti° en présence dénaturant
électrophorèse bi-dimensionnelle (protéomique)
migrat° prot selon combinaison critères pHi et taille
chaînes agarose chauffées -refroidissemt-> rég° en dble hélice liées par chaînes linéaires
acides nucléiques visibles sous UV via colorant phosphorescent bromure d'éthidium s'intercalant entre plateaux de base
faisant varier concentrat° d'acrylamide et méthylène (bis acrylamide) : obtient mailles très différentes par polymérisat°
SDS-PAGE : SDS se fixe à plupart prot via intéract° hydrophobes à raison d'1 mol de SD pr 2 AA
ttes prot ont un m^ rapport charge sur masse
déterminat° prot moléculaire d'1 prot : focalisat° où pH correspond à pHi
gel verticaux = polymérisat° acrylamide et bis-acrylamide
à son pHi : prot à charge globale nette = 0
gradient de pH établi par ajout sub amphotères = ampholytes
prot migrent tant que charge pas nulle cad à pH égal au pI
gradient de pH croissant
de manière électrique : pas frottemt
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IEF IsoElectroFocalisat° = immobilist° prot + ampholines à équilibre
IPG Immobilized pH Gradient = immobilisat° prot ds gradient pH préformé
immobilines = mol identiques aux ampholines ms immobilisées ds support électrophorétique définissant un gradient de pH fixe + stable
ampholines = mol amphotères présentes ds gel qui migreront entre bornes pH définies par solut° électrophorèse
NEPHG Non Equilibrum PH Gradient Electrophoresis = migrat° prot + ampholines sans atteinte équilibre
gradient pH évolue au cours migrat°
mol de pI donné atteignant partie gel où pH = pI continue migrer en suivant pH
résultat électrophorèse 2D
prot de m^ poids moléculaire (PM) et de pI différents séparés horizontalemt
prot de m^ pI et de PM différents séparées verticalemt
pas bande ms spot : mieux
électrophorèse bidimensielle
identificat° protéome
protéome change en fonct° du tps, dév, condit° extraCr, condit° intraCr
spectrométrie de masse
bio-informatique
protéomique = descript° dynamique de régulat° des gènes via étude prot + leurs modif post-traductionnelles
1 spot = 1 prot
tt spots au m^ endroit horizontalemt = m^ endroit sur gène SPS
recherche spot spé d'1 condit° donnée
permet cartographie de réf
MALDI-TOF : échantillon ds matrice subi pulse électrique provoquant ionisat° (où format° ions "voyageant"
MS & identificat° prot par profils de digest°
- digest° "in gel" par protéase spé
- analyse directe masse peptides par MALDI-TOF du mélange peptidique
banque de données de profil de digest°
- identificat° profil digestif peptidique
identificat° protéome
branche informatique appliquée à une partie bio : recherche sur gènes + prot