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BIOINFORMÁTICA 31-03-23, PIPELINE-DETECÇÃO-VARIANTES-GERMINATIVAS …

- - - - Sinal ">" Indica o cabeçalho (informações) da sequência
      - As linhas são quebradas em 60 caracteres
      - Cada ">" Indica uma sequência
    - - Phred Score
        
        É o cálculo usado para avaliar a confiança da chamada
        Q30 - Intervalo de confiança é de 99,9%
        
        FASTQC é um programa que representa graficamente a
        qualidade de uma amostra.
        
        (é o Q10/20/30)
        
        Vai de 33 a 136
  - - - Estruturado em um arquivo texto tabular (tabelas)
      - Descreve em qual região, em relação à referência, está localizado um mismatch
      - Sequence Alignment Map
      - Tempo elevado para busca de informações pois não estão indexadas
    - - É uma forma gráfica via IGV para diferenciar grupos entre padrões de picos de sequências (possível analisar perfil de metilação)
- - - - Contém info de:
        
        ID da amostra
        
        index 1
        
        index 2
        "AMOSTRA-INDEX1(TTAAGG)-INDEX2(TTTCCGA)
    - - Com base na samplesheet há conversão de
        BLC --> FASTQ via programa blc2fastq.
        
        Gera arquivo BLC --> FASTq
        "Amostra01_S02_R1_fastq.gz"
        "Amostra01_S02_R2_fastq.gz"
        
        FASTQ --> BAM
        
        BAM --> VCF
        
        Após VCF inicia a anotação da sequência
        
        VCF - carrega informações de variantes únicas de nucleotídeos (SNVs, inserções e deleções Indels)
        
        FASTQ é o arquivo mais bruto que geralmente é compartilhado.
- - - - Pontuais
        
        Silenciosa
        (mantém o mesmo aminoácido)
        
        Nonsense (gera um códon de parada)
        
        Misssense (gera aminoácido diferente)
      - Penetrância
        
        Completa - todos com a variante tem doença
        Incompleta - nem todos com a variante tem doença
      - Expressividade
        
        Não variável - todos com a doença tem o mesmo fenótipo
        Variável - a doença têm expressões diferentes entre os doente
    - - Germinativas (há frequência esperada que é de 50 ou 100%), diferentemente do somáticos, a ideia é identificar uma variante e correlacionar com uma doença específica. Permite estimar um prognóstico da doença.
        Outro ponto é que variantes germinativas podem ser herdadas, abrindo espaço para que o casal realize aconselhamento genético para descobrir o risco de recorrência da enfermidade na família
      - Somáticas (há variações de frequências que podem ser muito baixas - as vezes pode ser alta. Objetivo é encontrar alguma droga que possa auxiliar no tratamento da doença)
      - Há diferentes tipos de ensaios de NGS
        
        Gene único
        Painel de Genes
        Analise de SNP
        Exoma
        Genôma
      - PIPELINE DE BIOINFORMÁTICA
        
        Fases
        
        Primária
        
        Sequencia e com a chamada de bases, há criação do FASTQ
        
        bcl2fastq
        
        É instalado num servidor e alimenta ferramentas com arquivos:
        
        Informa a localização do bynary base call (os arquivos da corrida)
        
        Informa a localização da samplesheet
        
        Informa a pasta de saída
        
        SAMPLESHEET contém:
        
        numero da amostra
        
        barcode 1
        
        barcode 2
        
        parâmetros:
        
        normalmente aceita até 1 base errada no dual index em relação a samplesheet
        
        output - haverá um arquivo fastq para cada amostra R1 e R2 (pode definir se haverá um arquivo gerado para para cada lane ou tudo junto num único arquivo)
        
        definição - esta etapa separa as infos dos bcls em fastqs de acordo com a samplesheet
        
        É um dado binário gerado pelo equipamento
        
        FASTQC (checagem de qualidade dos fastqs
        
        input é arquivo r1, r2 e gera uma saída em html
        Mostra a distribuição da qualidade de todas as reads em cada ciclo na forma de boxplot.
        
        Mapeamento (fase em que o read é endereçado a um local da referẽncia; read ganha uma posição)
        
        O genoma de referência é usado em formato FASTA.
        
        bwa (preparo do genoma de referencia)
        
        2 more items...
        
        samtools (preparo do genoma de referência)
        
        2 more items...
        
        picard cria um dicionário das sequencias do dicionário já indexado. (preparo do genoma de referência)
        
        alinhamento - compara cada read com a referência. Pode alinhar em mais de um lugar, nesses casos, decide por qualidade de anelamento, se for a mesma qualidade, as vezes pode ser descartado.
        
        1 more item...
        
        Chamada de variantes
        
        6 more items...
        
        HG19 e HG38 são as referências mais utilizadas na prática clínica
        
        Secundária
        
        Mapeamento, criação de BAM (contém a posição da sequência)
        
        Chamada de variante e criação de VCF (comparação do genoma de referência e mostra o que está de diferente, as chamadas de variantes)
        
        Terciária
        
        Anotação e Priorização (com base nas anotações é realizado
        
        Anotação e priorização
        
        Anotação baseado no gene
        
        É um grande arquivo com lacunas, onde cada linha contém informações sobre um gene, incluindo posicionamento de inicio e fim de cada exon.
        
        Contém informações sobre a posição do transcrito que está sendo analisado, quais são as as variantes e qual o impacto sobre a proteína.
        
        Anotação baseado na região
        
        Acende flag de similaridade da variante encontrada para com a região - passa a ser revelante na análise de regiões muito simiares.
        
        Anotação baseada em variante
        
        Pode consultar o banco para visualizar se a variante encontrada está no banco
        
        Classificação de variantes
        (ACMG)
        
        Patogênica
        Provavelmente patogênica
        Incerta
        Benigna
        Provavelmente benigna
        
        Há 28 regras com distintas pontuações.
        Após essa análise, chega-se a um consenso
- - - - Para cada objeto, tem informações específicas que devem conter no banco.
        
        Ex. Gene (vem com nome, transcrito, se é codificador ou não)
        
        Ex. Transcrito (vem com variante, ID, gene referência)
      - ID:
        NC - cromossomo e sua versão
        NM - transcrito
        rsid - banco de SNPs de NCBI
      - Posição de variante: Cromossomo | Gene - se é exon ou intron | posição proteína ou codificante DNA | posição da alteração e a alteração envolvida.
    - - GnomAD
- - - - comando para ver lista de diretório em forma de galhos de árvore
    - - Programa que gera relatório de qualidade dos fastqs
      - Na prática é utilizado o multiqc - faz médias dos parâmetros de qualidade de uma corrida
    - - burrows-wheeler-aligner
    - - É um pacote para chamada de variantes (pacote de ferramentas para analise de genoma - genome analysis toolkit)
      - É usado para chamada de variantes germinativas
      - É usado haplotypecaller (só faz germinativos)
        
        Por meio de três parâmetros realiza a criação de vcf:
        
        SEQUENCIA DE REFERÊNCIA (FASTA)
        
        AMOSTRA INPUT (BAM)
    - - Pacote de ferramentas para manipular diversos formatos de arquivos de sequenciamento NGS p.ex. (SAM\BAM\CRAM\
    - - Pacote para eliminar sequencias pequenas dos fastqs
    - - zip
        
        usa unzip (para descompactar)
      - gz
        
        usa gunzip (para descompactar)
  - - - Baseado em gene
        
        Compara com banco de dados e retorna informação apenas de um gene
      - Baseado em região
        
        Compara com banco de dados apenas uma região - coordenada inicial e final
      - Baseado em filtro
        
        Apenas retorna as alterações que são match completo para coordenada, gene, incio e fim e referência e variante
      - Outras funcionalidades