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Mise en évidence d'un champignon ou d'un parasite - Coggle Diagram
Mise en évidence d'un champignon ou d'un parasite
Champignons d'intérêt médical
Champignons ou micromycètes = responsables de mycoses chez l'homme.
SCHEMA
Examen mycologique
Étapes de l'examen mycologique (champignons)
Étape 3 : Cultures après ensemencement sur milieu de Sabouraud :
Observa° macroscopique des colonies.
Observa° microscopique.
+/- autres tests enzymatiques, spectrométrie de masse, biologie moléculaire.
Étape 4 : Identifica° du champignon.
Étape 5 : Test de sensibilité aux antifongiques.
Étape 2 : Examen direct du prélèvement (sur sang à la recherche d'Ag ou d'Ac).
Étape 1 : Réaliser le prélèvement.
Le prélèvement
Si possible avant tout traitement sinon les champignons ne poussent pas.
Pour atteintes superficielles
Champignons se développent du sang vers la périphérie => évolu° centrifuge. Le champignon sera toujours à la jonc° entre la zone saine et la zone malade.
Peau glabre : prélever en périphérie.
Teigne : prélever cheveux et poils cassés courts.
Ongles : poudre sous unguéale (entre zones saines et zones malades).
+/- s'aider de la lumière de Wood : fluorescence verte pour certains dermatophytes.
Pour les atteintes profondes : Biopsies, LBA... : prélever de manière stérile et acheminer rapidement au laboratoire.
Examen direct (ED)
Levures : à l'état frais (entre lame et lamelle) ou après coloration.
Champignons filamenteux : À l'état frais (entre lame et lamelle) ou après coloration. Pour les squames, ajout de solution éclaircissante pour digérer la kératine (potasse).
Colorations
MGG (May-Grünwald-Giemsa), HES, Gram...
Colorants spécifiques (Calcofluor-white, Mycetcolor) qui nécessite un microscope à fluorescence.
Référence : imprégnation argentique (Gomori-Grocott) : particules d'argents fixées sur la paroi du champignon.
Étape essentielle du diagnostic
Oriente le diagnostic :
Un ED + / site normalement stérile = infection fongique.
Levures ou champignons filamenteux : différencie les diffs types de filaments : types "dermatophyte", type "asperfillaire", type "mucorale".
Si teigne : peut déclencher l'éviction scolaire si espèce anthropophage jusqu'à négativation de l'ED.
Si ED est positif : prévenir rapidement le clinicien pour débuter le traitement (l'identifica° par cultures est souvent longue : plusieurs jours à semaines +++).
Si ED est négatif : et si un champignon pousse en culture : se méfier des "contaminants" de culture (réensemencer, reprélever...).
Cultures
On fait des cultures après ensemencement du prélèvement sur milieux spéciaux (Sabouraud).
Macroscopiquement
T° de pousse : 30°C, 37°C voire plus.
Aspect (crémeux, sec, cotonneux, étoilé...) et couleur des colonies.
Durée : 24h à qq semaines.
Microscopiquement
Pour les levures : identifica° difficile. Recours à d'autres techniques : galeries d'identifica° enzymatique, tests d'agglutina°, milieux chromogènes, test de filamenta°, spectrométrie de masse (MALDI-TOF), biologie moléculaire.
Pour les champignons filamenteux : identifica° possible par les fructifica°. Sinon, biologie moléculaire ou MALDI-TOF.
Identification
Technique spectrométrique
= MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight).
Principe : une source d'ionisa° laser assistée par une matrice couplée à un analyseur de temps de vol permettant une sépara° en phase gazeuse d'ions en f° de leur rapport masse/charge visualisable sous forme d'un spectre.
En microbiologie : obtenu° d'un spectre spécifique d'espèce.
Avantage : + efficace et + rapide que les techniques classiques (levures +++, - bon pour les filamenteux).
Technique PCR
Identifica° d'une souche non identifiée par technique classique : PCR séquençage (long...).
PCR directement sur prélèvement, après étape d'extrac° de l'ADN :
Recherche d'ADN d'
A. fumigatus
,
Aspergillus
spp.
Recherche d'ADN de
Pneumocystis
.
Recherche d'ADN de mucorales, Candida, panfongique.
=> PCR recommandée dans certaines "guidelines" internationales.
Antifongigramme
= Test de sensibilité aux antifongiques.
Intérêt clinique : prédire l'efficacité thérapeutique (concordance ?) et adapter le traitement.
Mais pas ou peu de corrélation entre résistance cliniques et microbiologistes (in vivo/ in vitro) +/- antibiogramme. Mais peu de seuils de sensibilité (= breakpoints) déterminés.
Antifongiques
Résistances aux antifongiques : échec thérapeutique. Un échec thérapeutique n'est pas toujours lié à une éléva° de la concentra° minimale inhibitrice (CMI) du champignon. Une éléva° de CMI n'est pas toujours liée à un échec thérapeutique. Peu de corréla° entre les résistances in vitro et in vivo. Résistance multifactorielle.
Techniques : Résultat en 24 à 48h. La technique de référence est la microdilu° liquide. CLSI (Clinicat and Laboratory Standards Institute) -> norme américaine (gélose). EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibilité Testing) -> norme européenne (liquide).
Dilution en microplaque. Méthode de référence CLSI. Sur souches fraîches (24h) - Inoculum standardisé. Problème de disponibilité des antifongiques en poudre, de conserva° -> inadapté pour la routine.
E-test -> corrélation au CLSI. Lecture difficile : 100% inhibition : AmB ; 80% inhibition : azotés, 5FC. Réservés aux labos spécialisés (CHU car problème de lecture et de coût.
Galeries commercialisées : techniques non validées -> Fungitest, Sensitive Yeast One, et ATB Fungus.
Cas particulier :
Pneumocystis jirovecii
Prélèvements :
LBA +++, biopsie transpariétale (peu faite en France).
Crachats induits : peu sensible.
Mise en évidence :
Examen direct du prélèvement après coloration : Technique argentique rapide (Gomori-Grocott modifié) -> kystes. Coloration MGG (May-Grünwald-Giemsa) -> trophozoïtes et kystes.
Immunofluorescence indirecte.
Biologie moléculaire : PCR.
Méthodes indirectes
Utilisées uniquement en cas d'infec° profondes.
Recherche d'Ag solubles
Cryptococcus neoformans
= Dans sang et LCR, test d'agglutina° ou immunoenzymatique. LCR est très sensible, meilleur que l'examen direct à l'encre de chine.
Aspergillus
= Ag -> galactomannane, technique ELISA, dans sang +/- LBA; Ag recommandé chez les immunodéprimés (LA, allogreffés).
Candida
= Ag -> mannane, technique ALISA dans le sang. Sensibilité augmentée en associa° avec l'Ac (ELISA).
L'antigène panfongique = β-D-glucane. Détectable chez tous les champignons (y compris kystes de
Pneumocystis
) sauf les zygomycètes et
Cryptococcus neoformans
.
Recherche d'Ac sériques
Candida
=
Ac = anti-mannane, technique ELISA.
Sensibilité augmentée en associa° avec les Ag.
Candidémie et candidoses profondes chez les immunocompétents et les immunodéprimés.
Aspergillus
=
Techniques de dépistage : hémagglutina° et ELISA.
Techniques de confirmation : (électrosynérèse), immunoprécipitation ou western-blot.
Performante uniquement chez "l'immunocompétent" -> intérêt dans l'aspergillose localisée pulmonaire.
Examen histologique
Levure : l'EH ne permet pas de faire un diagnostic d'espèce.
Champignons filamenteux : l'EH ne permet ni un diagnostic de genre ni d'espèce... Seulement "aspect évocateur d'une aspergillose".
EH a pour but de prouver une infection fongique invasive.
Cryptococcose : Examen mycologique -> LCR (ED encre de chine), poumons, peau, biopsies... Histologie. Ag solubles -> LCR, sérum.
Pneumocystose : LBA > expectora° induites. Colora°, IF sur prélèvement (pas de culture). PCR. B-D-glucane. Pas de sérologie.
Candidoses profondes : Examen mycologique (Hémocultures, sites stériles ; sites superficiels : index de colonisa° -> patients à risque en réa). Histologie. Ag/ Ac sériques : mannane/ anti-mannane. B-D-glucane, PCR.
Aspergillose invasive : Exmane mycologique (poumons, sinus, sites sériques). Histologie. Ag solubles (GM chez l'immunodéprimé/ Ac aspergillaires chez l'immunocompétent). B-D-glucane, PCR.
Synthèse
Apport du labo.
Soit prélèvement profond (ponction, biopsie) -> réalisa° d'un examen histologique pour prouver que l'infec° est profonde.
Soit autres types de prélèvements -> réalisa° d'un ED pour rechercher des filaments puis quantifica°, cultures. Une fois la culture réalisée, on passera l'identifia° par MALDI-TOF.
Possible d'utiliser des méthodes indirectes.
Résultats minimum en 2 jours et maximum en 1 mois.